Практикум по физиологии. Практикум Под редакцией К. В. Судакова
 Скачать 2.13 Mb.
|
|
Рис. 1. Смесители: А — для под- счета эритроцитов; Б — для под- счета лейкоцитов. 1 — капилляр; 2 — ампула; 3 — наконечник Sudakov-Practicum-17_2016.indd 36 28.01.2016 15:36:04 37 ток в камере может быть не- равномерным. Для этого под микроскопом ищут большой левый верхний разграфленный квадрат. Подсчитывают коли- чество находящихся в нем эри- троцитов. Затем по диагонали вниз и направо находят следу- ющий разграфленный квадрат и т. д. Во избежание повторного подсчета одних и тех же эри- троцитов руководствуются следующим правилом. Под- считывают все эритроциты, находящиеся внутри каждого маленького квадрата. На раз- граничительных линиях эри- троциты подсчитывают только тогда, когда они большей сво- ей половиной заходят внутрь квадрата. Клетки, пересечен- ные разграничительной ли- нией пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах квадра- та — левой и верхней. Клетки, выходящие большей своей половиной за пределы разграничительных линий, не подсчитыва- ют. Результаты подсчета эритроцитов по каждому из пяти больших квадратов записывают отдельно и суммируют. Вычисление количества эритроцитов в 1 л крови проводят по формуле: E = N × 4000 × 200 × 106/80, где E — количество эритроцитов в 1 л крови, N — сумма эритроци- тов, подсчитанных в 80 маленьких квадратах, 4000 — множитель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, поскольку объем мало- го квадрата 1/4000 мкл, 200 — степень разведения крови, 106 — ко- Рис. 2. Счетная камера Горяева: А — вид сверху, Б — вид сбоку, В — сетка камеры Горяева. 1 — малень- кий квадрат; 2 — большой квадрат Занятие 4. Основные функции крови Sudakov-Practicum-17_2016.indd 37 28.01.2016 15:36:04 38 НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ. ПРАКТИКУМ личество микролитров в 1 л, 80 — количество маленьких квадратов, в которых считались эритроциты. Для получения более точного результата производится подсчет в двух сетках камеры Горяева и рассчитывается средняя арифмети- ческая величина количества эритроцитов. Оформление протокола 1. Зарисовать камеру Горяева и сетку камеры. 2. Записать формулу для расчета количества эритроцитов и вычис- лить это количество. 3. Сопоставить полученный результат с нормой. Работа 4.2. Определение количества лейкоцитов в крови В норме количество лейкоцитов в 1 л крови колеблется в преде- лах 4 × 10 9 /л–9 × 10 9 /л. Повышенное содержание лейкоцитов называется лейкоцитозом. Различают следующие виды лейкоцитоза: а) перераспределительный лейкоцитоз, возникающий за счет выхо- да крови в кровеносное русло из кровяного депо при физической нагрузке, шоке, операции; б) реактивный лейкоцитоз, который может быть вызван интокси- кацией, воспалительным процессом, инфекционными заболева- ниями; в) стойкий лейкоцитоз, наблюдающийся при лейкозах. Пониженное содержание лейкоцитов называется лейкопенией. Различают следующие виды лейкопении: а) функциональная лейкопения возникает при брюшном тифе, ви- русных заболеваниях, голодании, анафилактических состояниях, после приема некоторых фармакологических препаратов, после воздействия ионизирующей радиации; б) органическая лейкопения возникает при остром лейкозе, аплас- тической анемии. Цель работы. Научиться определять количество лейкоцитов в крови и оценивать это количество по сравнению с нормой. Оснащение: микроскоп, смеситель для лейкоцитов (рис. 1), счет- ная камера, покровное стекло, вата, фильтровальная бумага, разво- Sudakov-Practicum-17_2016.indd 38 28.01.2016 15:36:04 39 дящая жидкость, содержащая 3–5% уксусной кислоты и 1% метиле- нового синего. Исследование проводится на донорской крови. Содержание работы Разведение крови осуществляют в смесителе для лейкоцитов. В смесителе для лейкоцитов кровь разводят в 10 или в 20 раз. В ка- честве разводящей жидкости употребляют 3–5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим. Уксусная кислота лизирует эритроциты, и метиленовый синий окрашивает ядра лей- коцитов, делая их видимыми под микроскопом. Перед заполнением камеры Горяева смеситель с разведенной кровью тщательно встря- хивают. Камеру заполняют так же, как при подсчете эритроцитов. Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах. Эти квадраты сгруппированы по 4. Подсчет начинают с левой верхней группиров- ки квадратов, а затем продвигают камеру последовательно от группи- ровки к группировке. При подсчете лейкоцитов в каждом большом квадрате придерживаются правил, описанных для эритроцитов. Вычисление количества лейкоцитов в 1 л крови проводят по формуле: L = N × 4000 × 20 × 10 6 /1600, где L — количество лейкоцитов в 1 л крови, N — число лейкоцитов, подсчитанных в 1600 маленьких квадратов, 4000 — множитель, при- водящий результат к объему 1 мкл крови, поскольку объем малого квадрата 1/4000 мкл, 20 — степень разведения крови, 10 6 — количе- ство микролитров в 1 л, 1600 — количество маленьких квадратов, в которых подсчитывали лейкоциты. Оформление протокола 1. Записать формулу для расчета количества лейкоцитов и вычис- лить это количество. 2. Сопоставить полученный результат с нормой. Работа 4.3. Определение содержания гемоглобина в крови Гемоглобин является дыхательным пигментом эритроцитов, составляя до 90% их сухой массы. Гемоглобин — сложный белок, состоящий из собственно белковой части (глобин) и небелковой Занятие 4. Основные функции крови Sudakov-Practicum-17_2016.indd 39 28.01.2016 15:36:04 40 НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ. ПРАКТИКУМ части — простетической группы (гем), содержащей железо. Важней- шая функция гемоглобина — связывание, перенос и высвобождение кислорода. Гемоглобин также принимает участие в транспорте уг- лекислого газа в виде карбогемоглобина. Кроме этого, гемоглобин является главным внутриклеточным буфером, поддерживающим оптимальное для метаболизма рН. Содержание гемоглобина в нор- ме — 130–180 г/л. Определение количества гемоглобина имеет важ- ное клиническое значение и является обязательным компонентом любого анализа крови. Важнейшими методами определения коли- чества гемоглобина являются колориметрические. Цель работы. Научиться определять количество гемоглобина в крови и оценивать это количество по сравнению с нормой. Оснащение: гемометр Сали, 0,1% раствор HCl, дистиллированная вода, капилляр. Исследование проводится на донорской крови. Содержание работы Гемометр Сали состоит из пластмассового корпуса, в котором расположены три пробирки одинакового диаметра (рис. 3). Сред- няя пробирка пустая. На стенке ее имеется вертикально располо- женная градуировка. Две крайние пробирки герметично запаяны и содержат стандартный раст- вор солянокислого гематина светло-коричневого цвета. Интенсивность окраски стан- дартного раствора соответс- твует идеальному нормально- му содержанию гемоглобина 166,7 г/л (16,67 г%). В градуированную пробирку до нижней метки наливают 0,1% раствор соляной кислоты. В ка- пиллярную пипетку до отметки 0,1 набирают кровь и медленно выпускают ее под слой кис- лоты. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 5–10 мин. Соляная кислота соединяется с гемоглобином и превращает его в солянокислый Рис. 3. Гемометр Сали: 1 — про- бирки со стандартным раствором; 2 — пробирка с исследуемой кро- вью; 3 — смеситель; 4, 5 — пипетка и палочка для смешивания Sudakov-Practicum-17_2016.indd 40 28.01.2016 15:36:04 41 гематин. Полученный раствор солянокислого гематина темно-корич- невого цвета разводят водой до цвета стандартного раствора в боковых пробирках. Верхний уровень жидкости в средней пробирке указывает на шкале пробирки количество гемо глобина в крови. Оформление протокола 1. Записать ход измерения количества гемоглобина. 2. Зарисовать гемометр Сали. 3. Сопоставить полученный результат с нормой. Работа 4.4. Определение цветового показателя Цветовой показатель (ЦП) характеризует степень насыщения крови гемоглобином относительно степени насыщения крови эрит- роцитами. В норме ЦП равняется 0,9–1,1. Эритроциты с таким показателем называются нормохромными, с показателем больше 1,1 — гипер- хромными и меньше 0,9 — гипохромными. Цель работы. Научиться определять цветовой показатель крови и оценивать это количество по сравнению с нормой. Оснащение: результаты предыдущих опытов по количеству эри- троцитов и содержания гемоглобина в крови, номограмма. Содержание работы Цветовой показатель вычисляют по формуле: ЦП = (Hb1/Hb2)/(Er1/Er2), где Hb1 и Er1 — содержание гемоглобина и количество эритроци- тов в исследованной крови, Hb2 и Er2 — содержание гемоглоби- на (167 г/л или 100% по Сали) и количество эритроцитов (5 × 10 12 ) в норме. Затем определяют цветовой показатель по номограмме. Номо- грамма состоит из трех шкал: “а” — шкалы значений цветового показателя, “б” — шкалы значений содержания гемоглобина в % и “в” — шкалы значений количества эритроцитов в 1 мкл крови (рис. 4). На шкалах номограмм “б” и “в” находят значения, соот- Занятие 4. Основные функции крови Sudakov-Practicum-17_2016.indd 41 28.01.2016 15:36:05 42 НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ. ПРАКТИКУМ ветствующие количеству эри- троцитов и гемоглобина, изме- ренные в предыдущих работах. Найденные точки на шкалах номограмм соединяют прямой линией. По точке пересечения линии со шкалой “а” опреде- ляют величину ЦП. На номограмме приведен пример определения величины ЦП крови, когда число эритроцитов составляет 3,5 в 1 мкл крови и со- держание гемоглобина по Сали 70%. ЦП при этом равняется 1,0. Оформление протокола 1. Записать ход работы. 2. Зарисовать номограмму. 3. Сделать заключение о соответствии полученного результата среднестатистическому значению ЦП крови. Работа 4.5. Определение скорости оседания эритроцитов Эритроциты несвернувшейся крови при длительном хранении об- ладают свойством оседать на дне пробирки, склеиваясь друг с другом в “монетные столбики”, над которыми образуется слой прозрачной жидкости — плазмы. Эритроциты оседают потому, что их относи- тельная плотность больше, чем относительная плотность плазмы. Поверхность эритроцитов заряжена отрицательно. Этот дзе- та-потенциал эритроцитов обеспечивает в норме взаимное оттал- Рис. 4. Номограмма для опре- деления цветового показателя (ЦП) крови: а — шкала величин цветового показателя (безраз- мерная величина); б — шкала процентного содержания ге- моглобина по Сали в %; в — ко- личество эритроцитов в 1 мкл крови; прямая линия на номо- грамме — пример определения ЦП Sudakov-Practicum-17_2016.indd 42 28.01.2016 15:36:05 43 кивание эритроцитов, что поддерживает взвешенное состояние эритроцитов в крови. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) в пробирке зависит от белкового состава плазмы, главным образом, от соотношения альбуминов и глобулинов. В норме отношение количества альбуминов к глобулинам равно 1,5–2,3. Уменьшение коэффициента за счет увеличения количества глобулинов снижает дзета-потенциал и ускоряет СОЭ, что наблюдается при некоторых физиологических (беременность) и патологических (воспаление, туберкулез) процессах. Цель работы. Научиться определять СОЭ по методу Панченкова и оценивать СОЭ по сравнению с нормой. Оснащение: прибор Панченкова, лимоннокислый натрий. Иссле- дование проводят на донорской крови. Содержание работы Градуированную капиллярную пипетку (рис. 5) предварительно промывают 3,7% раствором цитрата натрия. Затем набирают в пи- петку этот же раствор до метки “Р”, что составляет 25 мкл. Цитрат натрия выливают в обычную пробирку. Исследуемую кровь наби- рают в капиллярную пипетку до метки “К”, что составляет 100 мкл. Кровь сливают в пробирку с цитратом и тщательно перемешива- ют. Затем вновь набирают в капиллярную пипетку смесь крови с цитратом натрия до метки “0”. Капилляр с цитратной кровью ставят вертикально между двумя резиновыми про- кладками в прибор Панчен- кова. В ходе измерения СОЭ необходимо поддерживать комнатную температуру в пре- делах 18–22 °С. Более низкая температура замедляет СОЭ, а более высокая температу- ра ускоряет СОЭ. Через час определяют величину СОЭ по высоте столбика плазмы над осевшими эритроцитами в миллиметрах. Рис. 5. Прибор Панченкова: К — кровь; Р — реактив; 0–100 — шкала высоты в мм Занятие 4. Основные функции крови Sudakov-Practicum-17_2016.indd 43 28.01.2016 15:36:05 44 НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ. ПРАКТИКУМ Оформление протокола 1. Записать ход работы. 2. Зарисовать прибор Панченкова. 3. Сделать заключение о соответствии полученного результата среднестатистическому значению СОЭ. Работа 4.6. Исследование химического гемолиза Процесс разрушения клеточной мембраны эритроцитов, при ко- тором гемоглобин выходит в плазму, называется гемолизом. Кровь после гемолиза представляет собой прозрачную жидкость красного цвета, которую называют лаковой кровью. Различают химический, осмотический, механический и термический гемолиз. Цель работы. Исследовать различные виды химического гемо- лиза. Оснащение: 4 пробирки, физиологический раствор, эфир, раствор HCl 0,1%, раствор аммиака. Исследование проводят на донорской крови. Содержание работы 4 пробирки размещают в штативе. В каждую пробирку наливают по 5 мл физиологического раствора и по 0,5 мл (5–10 капель) иссле- дуемой крови. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл эфира, во 2-ю пробирку — 1 мл 0,1% раствора HCl, в 3-ю пробирку — 5 мл раствора аммиака, в 4-ю пробирку — 5 мл физиологического раствора. Содержимое пробирок встряхивают в течение 30 с, а затем снова ставят в штатив и рассматривают их содержимое в проходящем све- те. При наличии гемолиза кровь становится лаковой. Оформление протокола 1. Записать ход работы. 2. Зарисовать пробирки с соответствующим цветом крови. 3. Объяснить причину химического гемолиза эритроцитов. Sudakov-Practicum-17_2016.indd 44 28.01.2016 15:36:05 45 Теоретические вопросы 1. Защитные функции крови: свертывающая и противосвертыва- ющая, фагоцитарная и иммунная функция, фибринолитическая функция. 2. Принципы классификации групп крови по системе АВ0. Харак- терные особенности каждой группы крови. Физиологические основы переливания крови. 3. Резус-фактор, значение для клинической практики. Механизм развития резус-конфликта. Развитие резус-конфликта в системе мать — плод. 4. Клинические методы определения групп крови и резус-факто- ра. 5. Правила переливания крови. Понятие донора и реципиента. 6. Физиологическое значение процесса свертывания крови. Ос- новные этапы гемостаза. Основные факторы свертывания. Роль тромбоцитов. 7. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и его фазы. 8. Коагуляционный гемостаз и его фазы. 9. Противосвертывающая система, ее взаимодействие со свертыва- ющей системой. 10. Фибринолиз, физиологическое значение для организма. Практические работы Работа 5.1. Определение группы крови по системе AB0 Существуют разные виды классификации групп крови. В основе разделения крови человека на группы по системе AB0 лежит нали- Занятие 5. Антигенные и защитные функции крови Sudakov-Practicum-17_2016.indd 45 28.01.2016 15:36:05 46 НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ. ПРАКТИКУМ чие на клеточной мембране эритроцитов белков агглютиногенов (A, B), а в плазме крови — белков агглютининов ( α , β ). A и α , B и β называются одноименными. В крови здорового человека не мо- гут одновременно находиться одноименные агглютиногены и аг- глютинины. При взаимодействии одноименных агглютиногенов и агглютининов происходит реакция агглютинации, т.е. склеивание эритроцитов. Изучение условий агглютинации эритроцитов сделало возмож- ным определение групп крови. Агглютиногены возникают у чело- века еще в эмбриональном периоде развития. Агглютинины появ- ляются позже, и количество их в сыворотке крови у детей первых недель после рождения небольшое. В зависимости от наличия или отсутствия в эритроцитах агглютиногенов и в плазме агглютининов различают четыре группы крови по системе AB0: I группа или 0 ( α , β ), II группа или А ( β ), III группа или В ( α ), IV группа или АВ (0). В настоящее время для определения группы крови используют синтетические цоликлоны анти-А и анти-В, которые являются ана- логами естественных агглютининов α и β плазмы крови. Цель работы. Научиться определять групповую принадлежность крови по системе АВ0. Оснащение: специальная розетка с нанесенными на ней обозна- чениями агглютининов сывороток крови, стандартные сыворотки I, II, III, IV групп крови или их аналоги — растворы искусственных цоликлонов, стеклянные палочки, пипетки. Исследование проводят на донорской крови. Содержание работы Для определения группы крови исследуемую кровь смешивают со стандартными сыворотками II и III групп, содержащими по од- ному агглютинину β или α соответственно. В настоящее время для определения резус-фактора используют синтетические цоликлоны анти-А и анти-В, которые являются аналогом естественных резус- антител плазмы крови. На специальную розетку пипетками наносят по крупной капле сывороток или цоликлонов III и II группы. Нельзя допускать сме- шивания этих растворов! Маленькую каплю исследуемой крови наносят рядом с каплей сыворотки с помощью стеклянной палочки и осторожно переме- Sudakov-Practicum-17_2016.indd 46 28.01.2016 15:36:05 47 шивают кровь с сывороткой. В другую сыворотку крови каплю исследуемой кро- ви вносят другой палочкой. Слегка покачивают розетку в течение 5 мин, наблюдая за каплями. Агглютинация эритроцитов выглядит в виде мелких красных крупинок, постепенно увеличивающих- ся в размере на фоне светле- ющей сыворотки. На основа- нии наличия или отсутствия агглютинации делают вывод о группе крови. Отсутствие агглютинации эритроцитов в обеих сыворот- ках служит доказательством принадлежности исследуемой крови к I группе крови. Если агглютинация произошла с сывороткой III группы крови, то исследуемая кровь II группы. Если агглютинация произошла с сывороткой II группы крови, то исследу- емая кровь III группы. В случае агглютинации эритроцитов в обеих сыворотках исследуемая кровь относится к IV группе (рис. 1). Полная схема возникновения агглютинации эритроцитов при взаимодействии агглютиногенов донора с агглютининами реципи- ента представлена в табл. 1. Таблица 1 |