Вирусы бактерий%0D. Учебное пособие для студентов Валеева Ю. В., Савинова А. Н. Казань кгму, 2018 с. 34 Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов специальности
 Скачать 0.88 Mb.
|
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Вирусы бактерий Казань, 2018 2 УДК 578.81(075.8) ББК 28.я73 авторский знак В52 Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета Авторы: Ю.В. Валеева, к.м.н., доцент кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ. А.Н. Савинова, к.б.н., доцент кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ. Рецензенты: Н.М. Хакимов, к.м.н., доцент кафедры эпидемиологии ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ; Л.Г. Морозова, к.б.н., доцент кафедры микробиологии «Казанская государственная медицинская академия» – филиала ФГБОУ ДПО РМАНПО Министерства здравоохранения РФ. Вирусы бактерий: учебное пособие для студентов / Валеева Ю.В., Савинова А.Н. – Казань: КГМУ, 2018 – с.34 Учебное пособие предназначено для студентов медицинских вузов специальности «Педиатрия» для самостоятельного изучения темы «Бактериофаги». Пособие составлено в соответствии с учетом требований Федерального государственного образовательного стандарта по специальности 31.02.03 «Педиатрия». Содержит основные понятия, сведения о строении, свойствах бактериофагов, практическом применении, вопросы для самоконтроля, тестовые задания и ситуационные задачи по теме: «Бактериофаги». Цели и задачи изучения раздела направлены на освоение ОПК 9 © Казанский государственный медицинский университет, 2018 3 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение 5 История открытия и изучения бактериофагов 5 Химический состав фагов 7 Антигенные свойства фагов 8 Морфология бактериофагов 8 Репродукция бактериофагов 10 Взаимодействие вирулентного бактериофага с бактериальной клеткой 10 Взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой 11 Методы изучения вирулентных фагов 14 Качественные методы определения бактериофагов 15 Практическое применение фагов 15 Лечебно – профилактическое применение бактериофагов 17 Коммерческие препараты бактериофагов 20 Вопросы для самоподготовки и самоконтроля 28 Тесты 28 Ситуационные задачи и ответы 29 Практическое занятие 31 Оснащение занятия 32 Литература 34 4 Цель – освоение студентами темы «Бактериофаги». Задачи: изучение свойств бактериофагов, способов практического применения их в микробиологии и в медицине, необходимых врачу педиатру для диагностики и лечения инфекционных заболеваний. Знания, умения и навыки, полученные студентами при изучении данного раздела, направлены на формирование общепрофессиональной компетенции: ОПК–9 способностью к оценке морфофункциональных, физиологических состояний и патологических процессов в организме человека для решения профессиональных задач В результате освоения ОПК–9 обучающийся должен: Знать: классификацию, морфологию и физиологию микроорганизмов и вирусов, их влияние на здоровье детей и подростков, методы микробиологической диагностики; применение основных антибактериальных, противовирусных и биологических препаратов; Уметь: пользоваться физическим, химическим и биологическим оборудованием; Владеть: навыками постановки предварительного диагноза на основании результатов лабораторного и инструментального обследования детей и подростков. 5 Введение Бактериофаги [от «бактерия», + греч. phagein, поедать] – группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Чаще репродукция дочерних популяций бактериофагов внутри бактерий вызывают их разрушение. Бактериофаги, или фаги, широко распространены в природе – их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, вода, выделения человека и животных и т.д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нем встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами черноземы и почвы, в которые вносились органические удобрения. Фаги, активные против разных видов кишечной, дизентерийной, тифозной и паратифозной палочек, часто встречаются в содержимом кишечника человека и животных, сточных водах и загрязненных водоемах. Фаги фитопатогенных микроорганизмов успешнее всего выделяются из остатков растений, пораженных этими микробами. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), морфология фагов, спектр действия, антигенная структура, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК – содержащим вирусам, с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т–фаги), лизирующие бактерии отдельных штаммов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов. История открытия и изучения бактериофагов. В 1896 году Эрнест Хэнкин установил наличие выраженной антибактериальной активности воды из Ганга и Джамны в отношении холерного вибриона. Эти свойства сохранялись после пропускания через бактериальные фильтры, но исчезали при кипячении. Хэнкин предположил, что подобные свойства воды из этих рек ограничивают распространения эпидемий холеры, но не смог объяснить этот феномен. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал Н.Ф. Гамалея (1898). При изучении свойств фильтратов сибиреязвенных бацилл, он установил его способность лизировать свежие культуры этих бактерий. В 1915 году Фредерик Туорт наблюдал аналогичные дегенеративные изменения колоний золотистого стафилококка, получившее название «стеклистое перерождение колоний». Под действием некоего фактора белые или желтые, непрозрачные колонии бактерий становились прозрачными и исчезали. Исследователи установили способность фильтратов переродившихся колоний заражать и убивать новые колонии бактерий. Это явление получило название «феномена Туорта», но его природа оставалась неизученной. Истинным открывателем бактериофагов стал Феликс д' Эрелль, 6 выделивший от больных дизентерией «анти–шигеллезный микроорганизм» (1915). Именно Ф. д' Эрелль (фото1), канадский сотрудник Института Пастера в Париже, ввел в практику термин «бактериофаги» – используя суффикс «фаг» не в прямом смысле «поглощать, поедать», а в смысле развития за счет чего-то. Он исследовал действие фильтратов испражнений больных дизентерией на шигеллы. После культивирования в термостате культура бактерий обычно вырастала, но однажды она не выросла, а растворилась, что совпало, по времени, с началом выздоровления больного. Это позволило Ф. д' Эреллю сделать вывод, что бактерии растворяет некий живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, то есть вирус. Путем многочисленных пассажей на культурах шигелл в качестве «клеток- хозяев», Ф. д' Эрелль размножил популяцию бактериофагов и установил их способность образовывать зоны лизиса на культурах шигелл, засеянных «газоном» на чашках Петри. Фото 1. Феликс д’ Эрелль (Хьюберт Феликс Августин Херенц) – выдающийся ученый- микробиолог, неоднократно номинированный на Нобелевскую премию, был самоучкой без высшего образования. 1905 г. Institut Pasteur – Musée Pasteur Лишь после создания электронного микроскопа была доказана вирусная природа бактериофагов и изучена их морфология. Открытие Ф. д' Эрелля привлекло внимание врачей и позволило использовать фаги для лечения и профилактики ряда инфекционных болезней. В 1934–1935 гг. д' Эрелль работал в Тифлисе (Тбилиси, Грузия), помогая в организации Международного Института Бактериофагов. С самого начала одним из главных направлений практического применения фагов было фагодифференцирование – идентификация бактерий путем определения спектра их чувствительности к специфическому набору фагов. Высокая эффективность метода обусловлена специфичностью многих бактериофагов в отношении их хозяев в связи с чем его широко используют во всем мире. 7 Не менее широко в лечении самых разнообразных инфекций использовалась фаготерапия. Фаги наносили непосредственно на место поражения, вносили внутрь, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, либо применяли в виде аэрозолей или клизм. Их даже вводили внутрь легких, в сонную артерию и перикард. В 40-х годах ХХ века началась эпоха антибиотикотерапии и везде, исключая СССР, разработки новых бактериофагов были вычеркнуты из числа перспективных исследований. Однако, уже в 80-е годы ХХ заговорили о снижении эффективности лечения антибиотиками вследствие выработки бактериями лекарственной устойчивости и интерес к фаготерапии возобновился. В начало 2000–х годов Гленн Моррис – сотрудник Мэрилендского Университета (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США, а в июле 2007 г. бактериофаги были одобрены для использования в США. На протяжении нескольких последних лет исследования свойств бактериофагов проводят в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии и т.д. В 1940–1950 гг. работы, проведенные Г.Дельбрюком, С.Луриа, А.Дерманомм, Р.Херши и А.Львоффом по изучению структуры и физиологии взаимодействий «хозяин-фаг», заложили основание для развития молекулярной биологии, которая, в свою очередь, стала фундаментом для целого ряда новых направлений биотехнологии. В настоящее время фаги широко используют в медицинской практике и при различных биологических исследованиях. В настоящее время изучением и применением бактериофагов занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии. По сравнению с бактериями, бактериофаги более устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они устойчивы в пределах рН 5,0 – 8,0, большинство из них резистентны к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола. Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, под действием УФ облучения, кислот, химических дезинфектантов и формалина. Они хорошо сохраняются при низких температурах (до – 200 о С в глицерине), но быстро инактивируются при 65 – 70°С. Вследствие отсутствия чувствительности к антибиотикам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору, эти вещества используют при выделении и сохранении фагов. Химический состав фагов Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК и, в зависимости от типа 8 нуклеиновой кислоты, их разделяют на ДНК–содержащие и РНК – содержащие. Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%). Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые, преимущественно, нейтральные жиры. Антигенные свойства фагов Все бактериофаги обладают антигенными свойствами, т.е. способны вызывать развитие тех или иных видов иммунного ответа. После введения фагов в организм опытного животного в сыворотке крови можно обнаружить специфические антитела, способные взаимодействовать только с конкретными фагами. Препараты таких сывороток называют антифаговыми. После взаимодействия фага с антителами, содержащимися в антифаговой сыворотке, происходит инактивация фага – он теряет способность инфицировать и вызывать лизис чувствительных к нему микробов. Поскольку действие каждой антифаговой сыворотки строго специфично, то их можно успешно применять для идентификации и классификации фагов, а также очистки микробных культур от фагов. С помощью фаговых антисывороток удалось доказать, что белки оболочки фага отличаются от белков чехла отростка, базальной пластинки и ее нитевидных образований, что говорит о сложности строения фаговой частицы. Морфология бактериофагов Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании чего выделяют пять основных типов бактериофагов (рисунок1). Рисунок 1 – Различные морфологические типы бактериофагов а. Фаги 1 типа; представлены ДНК-содержащими нитевидными фагами, лизирующими бактерии, содержащие F – плазмиды. б. Фаги 2 типа; представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК 9 в. Фаги 3 типа; имеют короткий хвост. г. Фаги 4 типа; включают фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК. д. Фаги 5 типа; представлены ДНК-содержащими вирусами с сокращающимся чехлом хвоста, который заканчивается базальной пластиной. Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т – фагов кишечной палочки (рисунок 2). Головка Т – фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, а также лизина. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутренний белок, обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. Рисунок 2 – Фаг Т4 кишечной палочки до контакта с бактерией (А) и в момент введения фаговой ДНК (Б) Хвост, или отросток, Т – фагов включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У некоторых Т – фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин). 10 Репродукция бактериофагов . По характеру взаимодействия бактериофагов с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные бактериофаги. 1. Взаимодействие вирулентного бактериофага с бактериальной клеткой В большинстве случаев бактерии, инфицированные бактериофагами, погибают, т.к. размножение и выход дочерних популяций из бактериальной клетки сопровождается её разрушением (лизисом). Такие вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как вирулентные бактериофаги. Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично, так как они инфицируют бактерии только определённого вида. Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клеточных рецепторах, инъекцию нуклеиновой кислоты внутрь клетки, взаимодействие с ДНК клетки-хозяина, образование копий вирусных белков и нуклеиновых кислот, самосборку и выход дочерних популяций (рисунок 3). Адсорбция. Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L –формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Адсорбция фага – пусковой момент его жизненного цикла, а специфичность взаимодействия с рецепторами на поверхности бактериальной клетки обусловливает, в том числе, возможность практического использования бактериофагов, например, для идентификации, бактерий, а также для фаготерапии и фагопрофилактики. Рисунок 3. Литическое взаимодействие фага с бактериальной клеткой 11 Инъекция фага. После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Затем вирусная ДНК «впрыскивается» в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). При этом структурные элементы фага – капсид и отросток – остаются вне клетки. Взаимодействие с геномом бактериальной клетки. Проникнув в клетку, нуклеиновая кислота фага «исчезает», т.е. диссоциирует, и уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (эклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион. Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. Репликация нуклеиновых кислот. Реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК–полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот. Выход дочерних популяций. Происходит объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК– содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. После образования потомства клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю фаговую популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов, либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий). |