билет 1 ген инж. 1. Как знание свойств искомого белка влияет на выбор стратегии его выделения и очистки. Способы лизиса клеток и первичной очистки. Хроматографические методы очистки белков. Аффинная хроматография
 Скачать 15.24 Kb.
|
|
1. Как знание свойств искомого белка влияет на выбор стратегии его выделения и очистки. Способы лизиса клеток и первичной очистки. Хроматографические методы очистки белков. Аффинная хроматография. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ Используются следующие свойства белков: Растворимость (зависит от ионной силы раствора, pH, температуры, наличия определенных ионов в растворе) Заряд. Размеры. Способность к взаимодействию с лигандами и другими веществами Этапы выделения белка: 1)Подготовка сырья( орг. и тк. Жив. И раст.), 2)Получение грубого экстракта. 3) Удаление низкомолек. В-в. 4) Выделение белк. Фракции. 5) Фракционирование( разделение белк. фракции на индивидуальные белки)6) Качеств. И коллич. Анализ белка. Установление его биологической функции. Получение грубого экстракта: 1)Гомогенизация биологического материала 2) Экстракция( извлечение растворителя)3) Удаление механических примесей Применяются фильтрация, замораж и размораж, центрифугтрование Центрифугирование: разделение частиц в зависимости от массы. Нерастворимые частицы осаждаются под действием центробежной силы. Супернатант- надосадочная жидкость. Супернатант – содерж. раствор. в-ва+ белки, низкомолек. в-ва, соли, углеводы, витамины Диализ. Вещ-ва с молек. Массо1 менее 1 кДА ( электролиты, аминокислоты, сахара) удаляются с помощью диализа. ПО градиенту концентрации ионы переходят в буферный р-р или Н2О. Крупные молекулярные вещ-ва остаются в мешке. Получение белковой фракции из диализата основан на основании растворимости белков: 1)Высаливание, -2)Метод замены растворителя ( добавл. Органич. Растворитель Ацетон, спирт), -3)Осаждение белков( изменение PH) Высаливание: р.-р белка + сильный электролит( сульфат аммония)-- происходит потеря гидратной (водной) оболочки белка, агрегация молекулы белка и осаждение, истончается гидратная оболочка белка. Разделение суммы белков на индивид. белки.( Метод основан на различных физ-хим св-в белка, растворимости, мол. массе,изоэлектрической точки):- 1)Методы колоночной хромоторгафии, - 2)методы электофореза.-3) метод дифференциального центрифугирования Хромотография- метод, основанный на распределении анализируемого вещ-ва между 2 несмешивающимися фазами. Колоночная хромотография:- вид хромотографии, основан на распределении в-в между неподвижной фазой (твердой матрицей) и подвижной фазой( растворителем), хромотографич. процесс протекает в колонке. Виды колоночной хромотографии: 1) Гельфильтрация, 2) Ионно-обменная( ионно- обменная смола ИОС) 3)Афинная 4) Высокоэффективная жидкостная(ВЭЖХ), 5) Газовая Афинная хромотография. Колонка наполняется матрицей, содерж. Ковалентно связанный с ней лиганд- в-во, специфич. Взаимодействующее с белком, кот. Необходимо очистить. Посторонние белки и примеси вымываются из колонки. Белок отделяется отлиганда путем промывания колонки солевым раствором, либо раствором, содерж. Большую часть лиганда.Комплекс лиганд+белок. Разделение электрофорезом ( метод, позв. Разделить смесь белков в зависимости от их мол. массы и заряда) |