1. Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала. Процесс приготовления гистологического препарата состоит из следующих этапов взятие и фиксирование материала,
 Скачать 313.12 Kb.
|
       1.Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала.Процесс приготовления гистологического препарата состоит из следующих этапов:
Взятие и фиксирование: максимальные размеры кусочков – 1*1*0,5см. фиксирующей жидкости не менее 1:9. Взятый образец ткани помещают в фиксатор: простой - спирт, формалин, раствор уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты или сложный – смеси простых фиксирующих жидкостей. Действие фиксаторов заключается в том, что удерживают клеточную структуру препарата в том состоянии, в котором их застигла смерть. Уплотнение материала: цель данного этапа – уплотнить препарат настолько, чтобы из него можно было сделать срез. Применяют уплотняющие срезы – парафин(1-4 часа), целлоидин(1-3 недели), желатин, органические смолы или замораживание. Сначала препарат избавляют от воды с помощью спирта, затем избавляют от спирта с помощью бензола, ксилола или хлороформа. Из уплотнённого образца вырезают блоки и готовят тонкие срезы. 2. Техника изготовления гистосрезов, их окраска и заключение. Приготовление срезов: самые тонкие (5-7мкм) срезы можно приготовить из материала в парафине. Из образцов в целлоидине срезы получаются толщиной 10-30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах. Срезы для эксперт-диагностики – на замораживающем микротоме. Окрашивание срезов: срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для светового микроскопа. Методы окраски: красители бывают кислые (окрашивают оксифильные срезы), основными ( окрашивают базофильные срезы) и специальными (вытесняют конкретные структуры, обладающие сродством с ними) . Нейтрофильные срезы окрашивают как кислые, так и основные красители. Распространён комбинированный метод окраски гематоксилин+эозин. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, затем заключают между предметным и покровным стеклом в канадский бальзам или синтетические смолы. 3. значение новых методов ( цитохимия, гисторадиография, люменисцентная или электронная микроскопия,) исследования для познания глубинных процессов жизни на клеточном и субклеточном уровнях. Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов. Гистоавторадиография – или АВТОРАДИОГРАФИЯ (ауторадиография) — способ регистрации альфа- и бета-излучений, основанный на фотохимическом действии ионизирующих излучений. Для обнаружения радиоактивных изотопов фотографическая эмульсия приводится в соприкосновение с исследуемым материалом, в результате чего альфа- и бета-частицы вызывают почернение фотоэмульсии в виде линий (треков) по ходу пробега частицы. Альфа-частицы дают прямые широкие треки, бета-частицы — узкие неравномерные зигзагообразные полоски. Люминесцентная микроскопия, метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами. Примером такого свечения являются известные всем лампы дневного света, в которых в результате облучения ультрафиолетовыми лучами светится специальный состав - люминофор, покрывающий изнутри колбу лампы. Электронная микроскопия — это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1—5 Å). Действие электронного микроскопа (рис.) основано на использовании направленного потока электронов, который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы). Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз. В биологии и медицине в основном используются электронные микроскопы просвечивающего типа. 4. строение клетки, как саморегулируемой системы организма. Клетка – наименьшая структурно-функциональная единица живой материи, состоящая из ядра, цитоплазмы с погружёнными в неё органеллами , раздражимой цитоплазматической мембраны и представляющая собой целостную, саморегулируемую, самовоспроизводящуюся систему. М.б. отдельным организмом, или входить в состав тканей и органов (специализированная клетка). В неё входят поверхностный, метаболический аппарат. 5. Поверхностный аппарат клетки Имеет сложное строение, в основе лежит плазматическая мембрана, с которой снаружи связан гликокаликс, изнутри опорно-сократительный аппарат гиалоплазмы. Плазмолемма – внешняя клеточная мембрана – смая толстая из цитомембран. Состоит из билипидного слоя, встроенных в него белковых молекул ( периферических, полуинтегральных, интегральных) и гликокаликса. Гликокаликс – слой полисахаридов, в котором находятся разветвлённые молекулы олигосахаридов, гликолипидов, гликопротеидов. Они выступают в роли антенн-рецепторов. Важный компонент мембраны – холестерол. Он определяет консистенцию мембраны. Все мембраны выполняют F: разграничительную, рецепторную, транспортную. Вещества, поступающие в клетку, могут выводиться из неё с помощью осмоса, диффузии, активного транспорта, а также могут транспортироваться через мембрану в клетку и обратно с помощью фагоцитоза, эндоцитоза, пиноцитоза, экзоцитоза. Также плазмолемма участвует в формировании межклеточных контактов – изолирующих ( или плотные, самые тесные соединения, блокирующие распространение веществ в межклеточном пространстве), механических ( устроены просто, по типу пальцевидных отростков, между мембранами формируется пластинка гликокаликса) , химических ( щелевые, или нексусы – осуществляют ионную и электрическую связь между клетками), электрических (представляют собой соединения в виде пятислойных структур, без синаптической щели.). 6. ультраструктурная организация и взаимосвязи органелл метаболического аппарата клетки. Все компоненты цитоплазмы функционально тесно взаимосвязаны и составляют единый метаболический аппарат. Цитоплазма клетки состоит из гиалоплазмы и обязательных клеточных органелл ( мембранных – ЭПС, аппарат гольджи, лизосомы, пероксисомы, митохондрии, транспортные вакуоли. Немембранных – рибосомы, центриоли, фибриллярные структуры. Специального назначения – реснички, жгутики.) а также различных видов непостоянных структур – включений. В гиалоплазме и органеллах проходят все этапы метаболических реакций, посредством которых клетка расщепляет одни малые молекулы и синтезирует другие, необходимые для её роста и функционирования. 7. ультраструктурная организация мембранных органелл клетки, их роль Мембранные органеллы - ЭПС, аппарат гольджи, лизосомы, пероксисомы, митохондрии, транспортные вакуоли. Биологическая мембрана – наиболее распространенный компонент структурной организации клетки. Все мембраны – тонкие липопротеидные слои. Выглядит мембрана так: в билипидный слой вкраплены белковые молекулы: поверхностные, пронизывающие, подмембранные. Билипидный слой представлен молекулами фосфолипидов. ЭПС. Это система внутриклеточных мембран. Бывает гладкая и гранулярная.иногда выделяют переходную. ГрЭПС с прикреплёнными к ней рибосомами обеспечивает синтез и транспорт предшественников белков. ГлЭПС с помощью встроенных в мембрану ферментов (в частности оксидаз) осуществляется детоксикация веществ. Она способна накапливать и транспортировать ионы, служить резервуаром для питательных веществ. ЭПС способна к глубоким перестройкам, участвует в транспорте веществ из одной части клетки в другую, а также за пределы клетки. Аппарат Гольджи. Пластинчатый комплекс на ряду с ЭПС и рибосомами входит в состав синтетического аппарата клетки. Представлен стопками уплощённых цистерн, вакуолями, или секреторными пузырьками, различного диаметра и транспортными пузырьками. Комплекс указанных элементов, имеющих мембранное строение, называется диктиосомой. АГ локализуется между ГрЭПС и плазматической мембраной. В его периферической зоне расположены полирибосомы, участвующие в выработке специфических ферментов для мембран АГ. Функция АГ – синтез полисахаридов, гликопротеидов, конденсация секреторных веществ, образование и упаковка секреторных гранул, сортировка белков. Лизосомы. Округлой или сферической формы пузырьки, окружённые одинарной мембраной. Содержат гидролитические ферменты (протеаза, липаза, нуклеаза, фосфатаза и др), способные разрушать природные полимерные органические соединения. Лизосомы участвуют во внутриклеточном пищеварении клетки. Среди лизосом встречаются первичные ( они подходят к пищеварительной вакуоли, сливаются с ней и образуют вторичные лизосомы), вторичные лизосомы обеспечивают расщепление частиц в фагосоме, после переваривания вторичные лизосомы превращаются в остаточные тельца, они удаляются из клетки путём экзоцитоза. Пероксисомы. Аналоги лизосом. Содержат гидролитические ферменты, образуются путём отпочковывания от ГлЭПС. Функция – окисление субстратов с образованием пероксида водорода, катализация распада жирных кислот, а значит участие в цикле кребса. Митохондрии. Подвижные тельца различных размеров и формы, ограниченные двуслойной мембраной. Внутренняя мембрана образует кристы. Матрикс содержит митохондриальную ДНК, рибосомы. Митохондрии участвуют в синтезе АТФ, отвечает за клеточное дыхание за счёт аэробного окисления органических соединений. 8. ультраструктурная организация немембранных органелл клетки, их роль. К немембранным органеллам относят рибосомы, центриоли, фибриллярные структуры. Рибосомы. Мелкие гранулы, на которых синтезируется белок путём соединения аминокислот в полипептидные цепочки. Информацию о синтезе приносит к рибосомам иРНК. Каждая рибосома состоит из 2х ассиметричных долей. Большой и малой. Эти субъединицы образованы рибосомальными РНК. В дальнейшем субъединицы через ядерные поры по отдельности поступают из ядра в цитоплазму, где участвуют в синтезе белка. Центриоли. Два коротких полых цилиндра, расположенных перпендикулярно друг другу и образующих клеточный центр. Стенку формирует 9 триплетов частично слипшихся микротрубочек, соединённых между собой белковыми мостиками. Снаружи центриоли окружены узкой полоской аморфного матрикса. Центриоли – самовоспроизводящиеся структуры. При подготовке клетки к митотическому делению они удваиваются. Они индуцируют полимеризацию белка тубулина, из которого образованы микротрубочки веретена деления, а также служат центром роста ресничек и жгутиков. Фибриллярные структуры. К данным структурам относят микротрубочки, микрофиламенты, промежуточные филоменты, играющие роль цитоскелета клетки. Микротрубочки представляют собой полые не ветвящиеся цилиндры. Микрофиламенты представляют собой короткие и самые тонкие нити белка актина. Промежуточные филаменты представляют собой прочные и устойчивые в химическом отношении нити. Формируют трёхмерные сети вокруг ядра. 9.Наследственный аппарат клетки. Структура и функции ядра на протяжении клеточного цикла. Ядро – обеспечивает хранение и передачу наследственной информации. В ряду клеточных поколений, служит центром управления обменом веществ в клетке, включая синтез белков. Если убрать ядро – клетка погибнет. В зависимости от жизненного цикла клетки различают: делящееся ядро в состоянии митоза, ядро, синтезирующее наследственный материал, интерфазное ядро. В ядре эукариот выделяют ядерную мембрану ( состоит из наружной и внутренней мембран, пронизана порами, внутреннюю мембрану подстилает внутренняя пластинка, ядерная оболочка может образовывать временные дин6амические связи с аппаратом гольджи), хроматин ( обнаруживается в виде глыбок и зёрен, окрашивающихся основным красителем. Представляет собой комплекс дезоксинуклепротеидов. Выделяют конденсированный (неактивные участки хромосом) и декондексированный (функционально активные участки хромосом) хроматин., ядрышко (производное хромосом, характеризуется большим содержанием рнк и её активным синтезом в интерфазе), кариоплазму ( включает в себя свободные нуклепротеиды, нуклеотиды, ферменты, белки-гистоны). Строение хромосом. Хромосома состоит из 2х хроматид, соединённых между собой перетяжкой. Снаружи хромосомы покрыты белковой оболочкой из гистонов. Хромосомы бывают различной формы – равноплечие, неравноплечие и в виде барабанной палочки. Состоят из днк и рнк. У всех соматических клеток диплоидный набор хромосом, у половых гаплоидный. F: хромосом заключается в синтезе специфических нуклеиновых кислот, из которых днк отвечает за хранение и передачу наследственной информации, а рнк управляет синтезом белка в клетке. ( здесь нужно посмотреть создание модели днк по уотсону и крику) молекула днк представляет собой две цепи, закрученные одна вокруг другой в спираль. Является полимером, в состав нуклеотида входят фосфорная кислота, дезоксирибоза, азотистое основание (аденин, тимин, гуанин, цитозин) Редупликация днк – удвоение – сводится к тому, что исходная спираль распадается на 2 цепочки, затем по принципу комплиментарности вокруг каждой цепочки достраивается ещё по одной цепочке, и ву-а-ля мы имеем две новых молекулы днк. Ген – участок днк, кодирующий информацию об определённом белке. Генотип – совокупность всех генов организма. Фенотип - внешнее проявление генотипа. 10. кариотип, митотические хромосомы, морфология, химический состав. Кариоти́п — совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток. Кариотипом иногда также называют и визуальное представление полного хромосомного набора (кариограммы). ДНК в составе хромосом может быть уложена с разной плотностью, в зависимости от их функциональной активности и стадии клеточного цикла. В связи с этим различают два состояния хромосом — интерфазные и митотические. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза. Это неработающие хромосомы, и молекулы ДНК в них уложены чрезвычайно плотно. Благодаря такой компактности митотических хромосом обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Дочерние клетки содержат диплоидный набор (идентичных родительской клетке) хромосом. Во время профазы хромосомы приобретают компактность, характерную митотическим хромосомам, они укорачиваются и утолщаются,становятся различимыми, но расположены хаотично. Во время метафазы пары хроматид выстраиваются по экватору. Во время анафазы хроматиды расходятся к полюсам клетки. Во время телофазы хроматиды деспирализуются, превращаются в хроматин. 11. нуклеиновые кислоты, роль, методы выявления, локализация в клетке, биосинтез белка. Существует два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота). Нуклеиновые кислоты обеспечивают хранение, воспроизведение и реализацию генетической (наследственной) информации. Эта информация отражена (закодирована) в виде нуклеотидных последовательностей. В частности, последовательность нуклеотидов отражает первичную структуру белков. Соответствие между аминокислотами и кодирующими их нуклеотидными последовательностями называется генетическим кодом. Единицей генетического кода ДНК и РНК является триплет – последовательность из трех нуклеотидов. Нуклеотиды – это органические вещества, молекулы которых состоят из остатка пентозы (рибозы или дезоксирибозы), к которому ковалентно присоединены остаток фосфорной кислоты и азотистое основание. Азотистые основания в составе нуклеотидов делятся на две группы: пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин, тимин и урацил). Дезоксирибонуклеотиды включают в свой состав дезоксирибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц). Рибонуклеотиды включают в свой состав рибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), урацил (У), цитозин (Ц). Методы выявления ДНК и РНК-возбудителей в настоящее время применяют в основном для диагностики вирусных инфекций. Методы выявления: Выявление РНК по методу Браше(фиксаторы могут быть различные, но наилучшие Карнуа,Бродского и Ценкера; заливка в парафин) Сущность метода заключается в избирательном присоединении некоторых основных красителей к нуклеиновым кислотам (при настоящем методе — пиронина к РНК и метилового зеленого к ДНК. Выявление ДНК по методу Фельгена(фиксаторф различные, но лучше Карнуа, Ценкера; заливка в парафин)Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы ДНК, осуществляемого в слабокислой среде, взаимодействия с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа ), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски- ее концентрацию. Локализация: РНК локализуется в основном в ядрышке, а ДНК в ядре в составе хроматина. Синтез белка. В биосинтезе белка определяют следующие этапы, идущие в разных частях клетки: Первый этап — синтез и-РНК происходит в ядре, в процессе которого информация, содержащаяся в гене ДНК, переписывается на и-РНК. Этот процесс называется транскрипцией (от лат. «транскриптик» — переписывание). На втором этапе происходит соединение аминокислот с молекулами т-РНК, которые последовательно состоят из трех нуклеотидов — антикодонов, с помощью которых определяется свой триплет-кодон. Третий этап — это процесс непосредственного синтеза полипептидных связей, называемый трансляцией. Он происходит в рибосомах. На четвертом этапе происходит образование вторич ной и третичной структуры белка, то есть формирование окончательной структуры белка. Таким образом, в процессе биосинтеза белка образуются новые молекулы белка в соответствии с точной информацией, заложенной в ДНК. Этот процесс обеспечивает обновление белков, процессы обмена веществ, рост и развитие клеток, то есть все процессы жизнедеятельности клетки. 12. Митотический цикл клетки, течение и биологическая сущность. Митоз (кариокинез). Клеточный цикл – это жизнь клетки от одного митотического деления до другого. Деление ядра – кариокинез. Деление цитоплазмы – цитокинез. Клеточный цикл состоит из 3х стадий: |