Занятие 8 ПФ. 1. Основные группы антимикробных мероприятий, используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний
 Скачать 1.41 Mb.
|
|
Тема: Действие химических и физических факторов на микроорганизмы. Антимикробные мероприятия. Антибиотики. Методы определения чувствительности микроорганизмов а антибиотикам (1 этап). 1. Основные группы антимикробных мероприятий, используемых для профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Существует множество мероприятий, направленных на создание безмикробной зоны в ЛПУ. Они могут быть разделены на прямые, косвенные и комплексные (рис. 6): 1) прямые - микробная деконтаминация - полное или частичное удаление микроорганизмов с объектов внешней среды и биотопов человека с помощью факторов прямого повреждающего действия 2) косвенные: разграничительные меры (разобщение потоков людей, помещений, транспорта и т.д., тормозящее миграцию возбудителей); меры воздействия на иммунную систему индивидуума (иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокоррекция); физические и механические методы воздействия, снижение численности микробной популяции (хирургическая, ультразвуковая, лазерная обработка ран, их дренирование и др.). 3) комплексные (сочетание прямых и косвенных методов) - асептика Асептика- комплекс прямых и разграничительных антимикробных мероприятий, целью которых является создание безмикробной зоны в местах нахождения больных, проведения лечебно-диагностических манипуляций и лабораторных исследований для предупреждения развития и распространения инфекционных болезней. Рис. 6. Группы антимикробных мероприятий прямого повреждающего действия Основные группы факторов, оказывающих прямое бактериостатическое и/или бактерицидное действие на микроорганизмы физические (табл.16); химические (табл.17); биологические (антибиотики, бактериоцины, бактериофаги и др.). МИКРОБНАЯ ДЕКОНТАМИНАЦИЯ - полное или частичное удаление микроорганизмов с объектов внешней среды и биотопов человека с помощью факторов прямого повреждающего действия МИКРОБНАЯ ДЕКОНТАМИНАЦИЯ объектов внешней среды МИКРОБНАЯ ДЕКОНТАМИНАЦИЯ биотопов человека Дезинфекция Стерилизация Химиотерапия Антисептика Таблица 16 Основные механизмы действия физических факторов на микроорганизмы Физический фактор Механизм действия 1.Действие температуры а) высокая температура б) низкая температура Коагуляция структурных белков и ферментов, нарушение осмотического барьера. Образование кристаллов воды и солей, разрушающих структуру клетки. 2.Действие Уф – лучей Повреждение нуклеиновых кислот за счет разрыва водородных связей и образования в молекулах ДНК-димеров тимина, что приводит к образованию нежизнеспособных мутантов. 3.Действие ультразвука Образование кавитационных полостей с высоким внутренним давлением газов и разрыв клетки. 4.Действие рентгеновского и γ- излучения Образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микроорганизмов. 5.Высушивание При относительной влажности ниже 30% жизнедеятельность бактерий прекращается. Лиофилизация- это быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким давлением; применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток) и для длительного хранения культур микроорганизмов. Таблица 17 Группы химических веществ с бактерицидным/статическим действием на микроорганизмы Группа Механизм действия 1. Красители: бриллиантовый зеленый, риванол, акрифлавин и др. блокировка фосфорнокислых групп нуклеопротеидов и задержка роста бактерий 2. Соли тяжелых металлов: Zn, Ag, Hg, Au коагуляция белков, образование альбуминатов металлов, олигодинамическое действие 3.Окислители: хлор- и йододержащие, перманганат калия, перекись водорода и др. повреждение сульфгидрильных групп белков и других групп (фенольные, индольные, аминные) 4. Поверхностно-активные вещества (ПАВ) Группа Механизм действия 1) катионные ПАВ - четвертично-амониевые соединения (ЧАС) 4-го поколения инактивация синтеза клеточных ферментов, денатурация белков, нарушение проницаемости ЦПМ 2) катионные ПАВ — полигуанидины (хлорге- ксидин, полимерные гуанидины -полисепт) разрушение клеточной мембраны, инги- биция ферментов, нарушение воспроизво- дящей способности нуклеиновых кислот и белков, угнетение дыхательной системы 3) амфотерные ПАВ — третичные амины ингибируют специфические ДНК-азы, повреждают клеточные мембраны 4) амфотерные ПАВ — спирты (этиловый) денатурация белков 5. надкислоты (препараты надуксусной кислоты — асесайд, надмуравьиной кислоты — первомур, новосепт) разрушение белков, ферментов, нарушение транспорта веществ через ЦПМ 6. альдегиды (глютаровый, ортофталевый) алкилирование амино- и сульфгидрильных групп протеинов и подавление синтеза белков, ингибирование трансмембранных механизмов транспорта, блокада комплекса периплазматических энзимов, инактивация дегидрогеназ. Дезинфекция – совокупность способов полного или частичного уничтожения потенциально патогенных для человека микроорганизмов на объектах внешней среды с использованием преимущественно химических факторов. Основная цель дезинфекции - разрыв путей передачи возбудителей инфекционных заболеваний от источников инфекции к восприимчивым людям. (W.Weuffen, H.Wigert, 1984). Термины и определения, применяемые в дезинфектологии Дезинфицирующее средство – физическое или химическое средство, включающее дезинфицирующий агент, обеспечивающий уничтожение патогенных и условно- патогенных микроорганизмов на объектах окружающей среды. Дезинфектант – химическое средство, обеспечивающее уничтожение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на объектах внешней среды. Бактерицидное средство – дезинфицирующее средство (препарат), обеспечивающее уничтожение бактерий в вегетативной форме. Вирулицидное средство – дезинфицирующее средство (препарат), обеспечивающее инактивацию вирусов. Фунгицидное средство – дезинфицирующее средство (препарат), обеспечивающий уничтожение грибов. Спороцидное средство – дезинфицирующее средство (препарат), обеспечивающий уничтожение спор микроорганизмов. Противоэпидемические мероприятия – комплекс санитарно-гигиенических, лечебно- профилактических, вакцинологических, дезинфекционных и административных мероприятий, направленных на предупреждение возникновения, локализацию и ликвидацию возникших эпидемических очагов инфекционных и паразитарных болезней. Требования, предъявляемые к дезинфектантам, используемым в медицинских учреждениях По антимикробной активности: должны обладать микробоцидным действием; иметь широкий спектр антимикробного действия в отношении бактерий и их спор, вирусов, грибов; обладать высокой эффективностью, т.е обеспечивать обеззараживание объекта при их использовании в небольших концентрациях в короткие сроки; обладать остаточным антимикробным действием; иметь незначительную зависимость активности от наличия загрязнений, изменений величины рН и понижения температуры. По токсичности: средства 2-го класса опасности – со средствами защиты органов дыхания, глаз, кожи, в отсутствии больных и пациентов; средства 3-го класса опасности – без средств защиты, в отсутствии больных и пациентов; средства 4-го класса опасности – без средств защиты, в присутствии больных и пациентов. По физико-химическим свойствам: иметь большое количество действующего вещества (ДВ); быстро растворяться в воде; иметь стабильность дезинфицирующего средства несколько лет (3-5), рабочих растворов – несколько часов; не должны обладать коррозионной активностью, разрушать и обесцвечивать ткани, обои, повреждать лакированные, полированные, синтетические поверхности и т.п., а также загрязнять окружающую среду, т.е. быть биоразлагаемыми. Желательно, чтобы кроме основного антимикробного действия, средства обладали дополнительными положительными действиями: моющим, дезодорирующим, отбеливающим, чистящим, а также имели гомогенизирующую способность при обеззараживании выделений (фекалии, моча, гной и др.) и остатков пищи. Различают профилактическую дезинфекцию и дезинфекцию в эпидемиологическом очаге. Профилактическая дезинфекция – комплекс дезинфекционных мероприятий, проводимый с определенной периодичностью в местах массового скопления людей, в том числе в ЛПУ, независимо от наличия инфекционных заболеваний Типы дезинфекции в эпидемиологическом очаге представлены в табл.18 Таблица 18 Типы дезинфекции в эпидемиологическом очаге Тип дезинфекции Цель Объекты дезинфекции текущая проводится в действующих эпидемических очагах для снижения массивности микробной контаминации и числа контаминированных объектов, чтобы затормозить процесс передачи возбуди- теля постельное и нательное белье, пеленки, полотенца, матрацы, подушки, мягкая мебель, ковры, посуда, ин- струменты, приборы, поверхности различных объектов, воздух, сточные воды заключи- тельная проводится в помещениях, где ранее находился инфекционный больной и на всех объектах внешней среды, имеющихся в этих помещениях для полного уничтожения возбудителей Дезинфицирующие средства, используемые в практике раствор хлорной извести 0,2 – 1%; раствор хлорамина Б или Т 0,2 – 4%; раствор кальция гипохлорита 0,5 – 5%; раствор анолита 0,5%; раствор перекиси водорода 3 – 6% с 0,5% моющего средства; раствор пероксимеда 3%; раствор полисепта 1%; раствор дезоксона 1 или 4 %; раствор демоса 5 – 10%% раствор спорокса 2 – 5%; раствор велтолена 1%; раствор аламинола 1%; раствор фогуцида 1%. Время обработки объекта составляет от 30 минут до 4 часов (в некоторых случаях до 12 – 24 часов) в зависимости от: объекта, подлежащего обеззараживанию; способа обеззараживания (орошение, протирание, замачивание, погружение, аэрозольный метод); используемого дезинфектанта и его концентрации. В современном лечебно-диагностическом процессе широко используются сложные медицинские устройства, вступающие в контакт со слизистыми оболочками или поврежденной кожей, например, эндоскопы, цистоскопы. Такие изделия могут быть повреждены при обработке традиционными методами стерилизации. Для их обеззараживания используют дезинфекцию высокого уровня (ДВУ), при которой происходит уничтожение всех вегетативных форм бактерий,в т.ч. микобактерий тубекулеза и большого числа (менее 10 -6) бактериальных спор, а также вирусов, включая возбудителей парентеральных гепатитов, ВИЧ-инфекции, грибов рода Сandida и дерматофитов. Для ДВУ часто используют комбинированные препараты со следующими сочетаниями дезинфектантов: глютаровый альдегтд + ЧАС, перекись водорода + надуксусная кислота, а также монопрепараты на основе глутарового, ортофталевого альдегидов. Антисептика – совокупность способов подавления роста или уничтожения потенциально патогенных микроорганизмов на интактных или поврежденных коже и слизистых оболочках при проведении лечебно-диагностических манипуляций, преимущественно с помощью химических веществ. Цель антисептики – предупреждение инфекционного процесса; нейтрализация источника инфекции; при антисептике рук – разрыв путей передачи инфекции. Форма выпуска антисептиков может быть различна: растворы, мыла, спреи, салфетки. Наиболее часто используемые антисептики: йодинол 1 % раствор, 1-5% спиртовая настойка йода, раствор Люголя, 70% спирт этиловый, 1-2% спиртовый раствор бриллиантового зеленого, 3% перекись водорода, 0,05-1,0% хлоргексидин, раствор фурацилина, 0,1—0,5% водные растворы перманганата калия, 2,4% первомура и др. Стерилизация – полное освобождение объектов внешней среды от любых микроорганизмов и их спор (рис.7) Цель стерилизации – разрыв путей передачи возбудителей инфекционных заболеваний от источника инфекции к восприимчивым людям. Рис. 7. Основные методы стерилизации Наиболее надежной и контролируемой является термическая стерилизация (табл.19). Таблица 19 Термическая стерилизация Вид термической стерилизации Режим Стерилизуемые объекты 1. паровой (водяным насыщенным паром под избыточным давлением – автоклавирование) 111 0 С-0,5 атм.(кгс/см 2 ) 20-30 мин. Питательные среды, содержащие углеводы 121 0 -127 0 С – 1,0- 1,5 атм.(кгс/см 2 ) 20-45 мин. Основные питательные среды, перевязочные материалы, изделия из резины и латекса. 133 0 С – 2 атм. (кгс/см 2 ) 20 мин. Изделия из коррозионно- стойкого металла, стекла, из текстильных материалов, резины. Патогенный материал, в т.ч. материал, зараженный спороносной микрофлорой 2. суховоздушная стерилизация (в печах Пастера, или сухожаровых шкафах) 160 0 С – 160 мин. 180 0 С – 40 мин. Изделия из металла, стекла, силиконовой резины. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Физические Химические Механичесие 1) газовые 2) жидкостные 1) фильтрация через Бактериальные фильтры (мембранные, асбестовые) 2) фильтрация через бактериальные свечи 1) термические 2) лучевые 3) ультразвуковые 3.дробная стерилизация текучим паром тиндализация 100 0 С – 40-60 мин. дробно 3 дня подряд Питательные среды, содержащие углеводы, молоко, желатин и др. 56-58 0 С – 60 мин. дробно 5-6 дней подряд Сыворотки, витамины, некоторые лекарственные вещества 4. прокаливание в пламени Бактериологические петли, иглы, пинцеты Химическая стерилизация используется ограниченно, поскольку существует ряд нежелательных эффектов при использовании данного вида обработки: 1) необходимость отмывания простерилизованного объекта от остатков стерилизанта (возможна повторная контаминация объекта); 2) длительность; 3) возможность побочного действия химического вещества на человека. Химическая стерилизация используется в случаях, когда по каким-либо причинам невозможно использовать другие способы (обработка крупногабаритных приборов, приборов с дорогостоящими деталями, требующими «щадящих» режимов, например, эндоскопов и т. д.). Основные способы и режимы химической стерилизации представлены в табл. 20 Таблица 20 Химическая стерилизация Газовая (предметы помещают в герметические контейнеры) Погружная (предметы погружают в раствор) 1. пары формальдегида 1 г/мл, влажность 80-90%, t 0 > 20 0 С, 24 ч. 2. окись этилена с добавлением СО 2 , 500-200 мг/мл, влажность 60-90%, t 0 > 20 0 С, 6-24 ч. 1. формалинэтил-алкоголь,24 ч. 2. формалин-изопропанол,24 ч. 3. раствор первомура 4. раствор анолита Для оценки эффективности стерилизации контролируют критические параметры (табл.21) Таблица 21 Критические параметры, контролируемые для оценки эффективности стерилизации Вид стерилизации Контролируемые критические параметры 1) суховоздушная Время экспозиции, температура 2) паровая Время экспозиции, температура, насыщенный пар 3) химическая (этилен оксидная) Время экспозиции, температура, концентрация газа, относительная влажность Для контроля качества термической и химической стерилизации используют различные индикаторы (табл.22) Таблица 22 Классификация индикаторов контроля качества стерилизации по принципу работы Группа индикаторов Принцип работы Преимущества метода 1) биологические индикаторы (БИ) Содержат тестовые микробные споры (B.subtilis или B.stearothermophilus), которые после стерилизации инкубируют в питательной среде 24-48 час. Является «золотым стандартом», т.к. только БИ определяют реальный факт гибели спор бактерий внутри стерилизатора 2) химические индикаторы Используют реакции химических веществ на воздействие факторов стерилизации (изменение цвета или оплавление при достижении критического значения не менее двух стерилизационных параметров). -дает ответ сразу после завершения работы стерилизатора -не требует наличия бак.лаборатории -прост в интерпритации Классификация индикаторов контроля качества стерилизации по способу применения: наружные (размещаемые на поверхности упаковки стерилизуемого объекта); внутренние (размещаемые внутри упаковки). 2. Классификации антибиотиков и принципы рациональной антибактериальной терапии. Термин химиотерапия, впервые предложенный П.Эрлихом, подразумевает использование лекарственных средств для уничтожения возбудителей инфекций в организме человека и животных без вреда для последних. Классификация химиотерапевтических средств В настоящее время средства, применяемые для химиотерапии, по происхождению принято делить на: 1) антибиотики; 2) синтетические антибактериальные средства разных химических групп. Антибиотики - лекарственные средства биологического происхождения, способные избирательно подавлять возбудителей заболеваний в организме хозяина. К группе антибиотиков также относят их производные и синтезированные аналоги. Существует несколько принципов классификации антибиотиков (табл. 23, 24, 25). Таблица 23 Классификация антибиотиков по происхождению № п/п Продуценты Примеры антибиотиков 1. Грибы родов: - Penicillum Группа пенициллинов: -бензилпенициллин (природный) - метициллин, оксациллин, ампициллин (полусинтетический) - Cephalosporium Группа цефалоспоринов: -ценорин -кефзол и др. 2. Актиномицеты рода Streptomyces Полиеновые (нистатин, леворин, амфотерицин, пимафуцин) Группа стрептомицина Аминогликозиды (неомицин, мономицин, канамицин, гентамицин) Тетрациклины: тетрациклин Линкомицин Левомицетин Макролиды (эритромицин, азитромицин) Рифамицины 3. Бактерии: - Bacillus polymyxa Группа полимиксина: -полимиксин М, В - Bacillus brevis грамицидин С 4. Животного происхождения Лизоцим 5. Растительного происхождения Фитонциды Таблица 24 Классификация природных антибиотиков в зависимости от химической структуры № п/п Название группы Некоторые представители 1. β- лактамы: 1. пенициллины 2. цефалоспорины 3. монобактамы 4. карбопенемы Бензилпенициллин, оксациллин, цефотаксим 2. Макролиды Олеандомицин, эритромицин 3. Линкозамиды Линкомицин, клиндамицин 4. Аминогликозиды Стрептомицин, амикацин, Гентамицин 5. Тетрациклины Доксициклин 6. Полимиксины Бацитрацин, полимиксин В, М 7. Полиеновые антибиотики Нистатин, Амфотерицин В 8. Рифампицины Рифампицин 9. Производные Левомицетин диоксиаминофенилпропана 10. Фузидин Грицеофульвин 11. Гликопептиды Ванкомицин, тейкопланин 12. Ристомицин Ристомицин Таблица 25 Классификация антибиотиков по механизму действия на микробную клетку Механизм действия Примеры антибиотиков 1.Нарушение синтеза клеточной стенки или ее компонентов бетталактамные, гликопептидные 2.Нарушение морфофункциональной организации цитоплазматической мембраны полимиксины, полиены 3.Ингибирование синтеза белка на уровне РНК-полимеразы рифампицины 4.Ингибирование синтеза белка на уровне рибосом тетрациклины, левомицетин, макролиды По спектру действия антибиотики классифицируются на: - антибактериальные, - противогрибковые, - антипротозойные, - противовирусные, - противоопухолевые. Синтетические химиотерапевтические средства (ХТС) - это группа веществ разного химического строения и механизма действия на микроорганизмы, которые используются для антимикробной терапии (табл.26) Таблица 26 Основные группы синтетических химиотерапевтических средств № п/п Группа ХТС Примеры препаратов 1. Сульфаниламиды Сульфадиметоксин, фталазол, ко- тримаксозол (комбинированный с триметопримом) 2. Производные хинолонкарбоновой кислоты 3-го поколения - фторхинолоны Ципрофлоксацин, норфлоксацин, дифлоксацин 3. нитрофураны Фурадонин, фурагин, энтерофурил 4. 8-оксихинолоны Энтеросептол, нитроксолин 5. нитроимидазолы метранидазол 6. производные хиноксалина диоксидин 3. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам Различают эмпирическую противомикробную терапию и противомикробную терапию при установленной чувствительности возбудителя к антибиотикам. Эмпирическое лечение начинают в соответствии с протоколами еще до выделения возбудителей инфекции из организма больного и постановки антибиотикограммы – определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Эмпирическая антибиотикотерапия может иметь нежелательные последствия: - если до лечения не взят материал для бактериологического и других видов исследования, то диагноз остается неясным и осложняется дальнейший выбор лекарственного препарата; - если штамм бактерий, являющийся причиной инфекции, оказывается мало- или нечувствительным к выбранным препаратам, то неоправданным являются расходы на лечение и возможные токсические эффекты антимикробной терапии; - при использовании антибиотиков широкого спектра действия, как правило, происходит селекция резистентных штаммов, ведущая к клинической неэффективности лечения. Антибиотикограмма выполняется с чистой культурой выделенных от пациента бактерий. Для обеспечения этого требования необходимо соблюдать следующие правила взятия материала на исследование: 1) материал должен быть получен до начала антибактериальной терапии или через срок, равный периоду полувыведения антибактериального препарата из организма; 2) материал для посева следует брать непосредственно из очага инфекции с соблюдением правил асептики (стерильными инструментами в стерильную посуду); если взятие материала непосредственно из очага инфекции невозможно, но он сообщается с внешней средой, можно провести исследование соответствующего отделяемого (моча, мокрота и др.); 3) материал высевают на соответствующий набор питательных сред, используемых для выделения чистых культур различных видов микроорганизмов; 4) если патологический процесс вызван микробной ассоциацией, раздельно исследуют чувствительность к антибиотикам всех членов ассоциации, выделенных в чистой культуре. Способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам Исследование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам проводят стандартными унифицированными методами, регламентированными официальными инструкциями. Существует несколько способов, которые можно разделить на следующие группы (рис.8) Способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам Регламентрованные (описанные в нормативных документах) Нерегламентрованные Диффузионные 1. диско- диффузионный 2. Е-тест (эпсилон-тест) Серийных разведенй 1. в бульоне 2. в агаре Ускоренные Автоматизи- рованные (в баканализа- торах) Рис. 8. Способы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. 1. Принцип диффузионных методов основан на диффузии в агар антибиотиков, нанесенных на бумажные диски или полоски, при наложении их на засеянную культуру микроорганизмов. Диффузия антибиотика приводит к образованию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков или полосок после инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение суток, если исследуемый штамм проявляет чувствительность к препаратам. При использовании диско-диффузионного метода результат учитывают путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах, сравнивая с данными таблиц из методических указаний (МУК «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). На основании размеров зон культуры относят к одной из трех групп: чувствительные, промежуточные и резистентные. Диско-диффузионный метод относится к полуколичественным. Он прост в исполнении, экономичен, не требует специального оборудования, доступен для любой бактериологической лаборатории, поэтому именно он является основным способом тестирования чувствительности микроорганизмов и используется в рутинной практике. При исполнении метода Е-тестов используют не диски, а полоски, на определенные участки которых антибиотик нанесен в различных концентрациях - по градиенту концентраций от максимальной к минимальной. В результате формирующиеся зоны задержки роста культуры приобретают эллипсовидную форму В месте пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста находится минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибиотика. Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений, является количественым, однако ввиду высокой стоимости тест- полосок не нашел широкого применения в практике. 2. Методы серийных разведений основаны на приготовлении последовательных двукратных разведений антибиотика (АБ) от максимальной рабочей концентрации к минимальной. Разведения можно выполнять в жидкой среде (в пробирках или лунках полистироловых планшет) или агаре. В результате в каждой последующей пробирке (или лунке) ряда концентрация АБ уменьшается в 2 раза по сравнению с предыдущей. Далее взвесь, приготовленную из чистой культуры исследуемых микроорганизмов, вносят во все разведения АБ в бульоне или на поверхность агара в чашках. Результаты учитывают после термостатирования в течение суток при 35 о -37 о С по наличию/отсутствию роста микроорганизмов в средах. Находят последнюю пробирку ряда (лунку, чашку) среди тех, где еще отсутствуют признаки роста микроорганизмов - она соответствует наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей видимый рост штамма. Такая концентрация называется минимальной подавляющей концентрацией (МПК), или минимальной ингибирующей концентрацией (МИК); измеряется в мг/л. Данные методы являются точными, количественными, однако они очень трудоемки. Это не позволяет их использовать в повседневной практике. 3. Атоматизированные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБ предусматривают учет результатов с помощью приборов типа бактериологических анализаторов. Для тестирования используют методы серийных разведений или пограничных концентраций, проводимые в коммерческих полистироловых 96-луночных планшетах. В лунках планшет находятся лиофильно высушены убывающие концентрации антибиотиков в бульоне или только в две концентрации - высокая и низкая (высокая соответствует границе между устойчивыми и умеренно устойчивыми штаммами, а низкая концентрация — границе между умеренно устойчивыми и чувствительными штаммами). Далее в лунки вносят суспензии исследуемых штаммов в одинаковой дозе с соблюдением правил асептики и инкубируют при 37 о С от 4-6 часов (в экспресс-режиме) до 24ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу после появлении признаков размножения нечувствительных к данному антибиотику штаммов. Процессы инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности взвеси в каждой лунке, графическое отображение результатов, определение степени чувствительности и печать протокола исследования выполняются с помощью приборов. Одновременно возможно тестирование культуры к 20 и более антибиотикам. Данный метод является наиболее точным, стандартным и нетрудоемким, однако имеет высокую стоимость и потому доступен только крупным диагностическим центрам. 4. Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБ позволяют сократить время исследования до нескольких часов, однако являются ориентировочными и требуют подтверждения в стандартных тестах. К этой группе можно отнести: методы регистрации ферментативной активности микроорганизмов при росте нечувствительных штаммов на дифференциальных средах в присутствии антибиотиков; методы, основанные на изменении цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно-восстановительного потенциала среды в процессе роста микробов в присутствии антибиотиков. Методики проведения лабораторных работ Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений Цель исследования - определение минимальной, или подавляющей, концентрации антибиотика, ингибирующей видимый рост исследуемой культуры бактерий (МИК, или МПК). 1 этап. Готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мг/л) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него делают последовательные двукратные разведения антибиотика в 7-8 пробирках в соответствии со схемой 3. Далее ко всем разведениям добавляют по 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии с концентрацией бактерий, соответствующей стандарту мутности 0,5 по MсFarland (10 8 м.т./ мл). В предпоследнюю пробирку ряда вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры), а в последнюю - 1 мл бульона и 1 мл антибиотика (контроль АБ). Посевы инкубируют при 37 0 С 24 часа. Схема 3 Определение чувствительности бактериальной культуры к антибиотику методом серийных разведений № пробирок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Разведение антибиотика мг/л 50 25 12, 5 6, 25 3, 12 1, 56 0, 78 0, 39 КК КА Б Ингредиенты МПБ (мл) 0,1 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 Бензиллпеницил лин (100 мг/л) 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 – 1,0 взвесь S.aureus (мл) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 – 1,0 в дез.раствор 2 этап. Учитывают результаты опыта по помутнению питательной среды. Последняя опытная пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемого штамма S.aureus под влиянием антибиотика в минимальной ингибирующей концентрации (МИК, МПК). Пример учета: № пробирки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 "+" (диффузно-мутящий рост) "–" (прозрачная среда - отсутствие роста) – – – – + + + + + – В данном примере МИК бензилпенициллина для S.aureus – 6,25 мкг/мл. Оценку результатов проводят, используя таблицу из МУК «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» 4.2.1890-04. В таблице представлены значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов (табл.27). Делают заключение о степени чувствительности исследуемого штамма S.aureus к бензилпенициллину. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диско- диффузионным методом 1 этап. 1 мл суспензии (10 8 м.т./ мл) исследуемой бактериальной культуры распределяют «сплошным газоном» на пластинке агара Мюллера-Хинтона. Засеянную поверхность подсушивают и на нее с помощью стерильного пинцета накладывают бумажные диски, содержащие определенную дозу разных антибиотиков на одинаковом расстоянии друг от друга и от края чашки (2см). Посев инкубируют при 37 0 С 24 часа. 2 этап. Учет результатов производят путем измерения диаметров (в мм) зон задержки роста микробов вокруг дисков с антибиотиками. Оценку результатов проводят по таблице из МУК (табл.27), в которой представлены пограничные значения диаметров для устойчивых, промежуточных и чувствительных штаммов. К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при использовании обычных терапевтических доз антибиотика, они не имеют механизмов резистентности; для подавления роста культур с промежуточной чувствительностью требуются введение максимально разрешенных концентраций. Устойчивымиявляются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз. Таблица 27 Критерии интерпритации результатов определения чувствительности Staphilococcus spp.: пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и МПК (мг/л) АБП Антибактериальн ые препараты Соде ржа- ние в диске Диаметр зон подавления роста (мм) МПК (мг/л) Р П Ч Р П Ч 1 2 3 4 5 6 7 8 Бета-лактамы 1 Бензилпеницилл ин 10 ЕД ≤28 - ≥9 ≥0,25 - ≤0,12 Оксациллин S.aureus Коагулазонегати вные стафилококки 1 1 ≤10 ≤17 11-12 - ≥13 ≥18 ≥4 ≥0,5 - - ≤2 ≤0,25 Аминогликозиды Канамицин 30 ≤13 14-17 ≥18 ≥84 32 ≤16 Гентамицин 10 ≤12 13-14 ≥15 ≥16 8 ≤4 Тобрамицин 10 ≤12 13-14 ≥15 ≥16 8 ≤4 Нетилмицин 30 ≤12 13-14 ≥15 ≥32 16 ≤8 Амикацин 30 ≤14 15-16 ≥17 ≥64 32 ≤16 Хинолоны Норфлоксацин 10 ≤12 13-16 ≥17 ≥16 8 ≤4 Эноксацин 10 ≤14 15-17 ≥18 ≥8 4 ≤2 Пефлоксацин 5 ≤15 16-21 ≥22 ≥8 4 ≤1 Офлоксацин 5 ≤12 13-15 ≥16 ≥8 4 ≤2 Ципрофлоксацин 5 ≤15 16-20 ≥21 ≥4 2 ≤1 Ломефлоксацин 10 ≤18 19-21 ≥22 ≥8 4 ≤2 Левофлоксацин 5 ≤13 14-16 ≥17 ≥8 4 ≤2 Сапрофлоксацин 5 ≤15 16-18 ≥19 ≥2 1 ≤0,5 Гатифлоксацин 5 ≤14 15-17 ≥18 ≥8 4 ≤2 Тетрациклины Тетрациклин 30 ≤14 15-18 ≥19 ≥16 8 ≤4 Доксициклин 30 ≤12 13-15 ≥19 ≥16 8 ≤4 Миноциклин 30 ≤14 15-18 ≥19 ≥16 8 ≤4 Макролиды Эритромицин 15 ≤13 14-22 ≥23 ≥8 1-4 ≤0,5 Кларитромицин 15 ≤13 14-17 ≥18 ≥8 4 ≤2 Азитромицин 15 ≤13 14-17 ≥18 ≥8 4 ≤2 Линкозамиды Линкомицин 15 <17 17-20 ≥21 >8 4-8 ≤2 Клиндамицин 2 ≤14 15-20 ≥21 ≥4 1-2 ≤0,5 Гликопептиды Ванкомицин 30 - - ≥15 ≥32 8-16 ≤4 Другие препараты Хлорамфеникол 30 ≤12 13-17 ≥18 ≥32 16 ≤8 Ко-тримоксазол 1,25/ 23,75 ≤10 11-15 ≥16 ≥4/76 - ≤2/38 Нитрофурантоин 300 ≤14 15-16 ≥17 ≥128 64 ≤32 Рифампицин 5 ≤16 17-19 ≥20 ≥4 2 ≤1 Фузидин 10 <15 15-21 ≥22 ≥32 4-6 ≤2 Линезолид 30 - - ≥21 - - ≤4 Антибактериальн ые препараты Соде ржа- ние в диске Диаметр зон подавления роста (мм) МПК (мг/л) Р П Ч Р П Ч 1 2 3 4 5 6 7 8 Штаммы, устойчивые к оксациллину, должны однозначно рассматриваться как устойчивые ко всем доступным бета- лактамам. 4. Механизмы формирования резистентности бактерий и методы определения маркеров резистентности. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и другим антибактериальным средствам - это способность микроорганизмов размножаться в присутствии различных концентраций этих препаратов. По происхождению различают два вида устойчивости: Первичная (видовая) – складывается в процессе эволюции видов, например, микоплазмы не чувствительны к пенициллину из-за отсутствия у них клеточной стенки; Приобретенная - возникает в изначально чувствительной к препарату популяции в процессе ее жизнедеятельности; такая резистентность может быть результатом: а) мутаций в хромосомных генах, контролирующих образование структурных и химических компонентов клетки, являющихся «мишенью» для препарата; б) передачи внехромосомных факторов наследственности (R-плазмид, умеренных фагов) при рекомбинациях. Биохимические механизмы резистентности бактерий к антибиотикам: 1) образование ферментов, разрушающих антибиотики. Наиболее частый механизм резистентности связан с синтезом β-лактамаз. β-лактамазы — различные бактериальные ферменты, способные расщеплять или ингибировать β-лактамные антибиотики, содержащие в своей структуре циклическую амидную связь. Такие ферменты могут иметь как Грам+, так и Грам- бактерий. В практике очень важно быстро установить их наличие для определения плана лечения пациента, так как штаммы, продуцирующие β-лактамазы, будут не чувствительны к действию β-лактамных антибиотиков (всей группы или отдельных представителей); 2) утрата проницаемости клеточной стенки для определенного препарата; 3) нарушение в системе специфического транспорта данного препарата в бактериальную клетку; 4) возникновение у микроорганизмов альтернативного пути образования жизненно важного метаболита, заменяющего основной путь, блокированный препаратом. Методы выявления маркеров резистентности бактерий к антимикробным препаратам 1) фенотипические: определение β-лактамаз в хромогенных тестах - основаны на изменении цвета специальных субстратов и индикаторов, которые вместе с антибиотиком наносятся на диагностические диски, полоски или находятся в питательной среде; окрашивание или обесцвечивание появляется в результате гидролиза антибиотика под действием фермента β-лактамазы (например, нитроцефиновый тест); определение у энтеробактеий β-лактамаз расширенного спектра действия методом «двойных дисков» по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с цефалоспорином 3 поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту; выявление дополнительного и модифицированного пенициллиносвязывающего белка стафилококков по резистентности к оксациллину или метициллину; 2) генетические: Выявляют у микроорганизмов генетические детерминанты, кодирующие плазмидную или хромосомную устойчивость к определенным группам антибиотиков. Тестирование проводится в экспресс-режиме (6-8 часов), без предварительного выделения чистой культуры возбудителя, что очень важно при работе с трудно- или длительно культивируемыми видами: методы на основе ПЦР - разработаны для M.tuberculosis, стафилококков, E.coli, K.pneumoniae, вируса простого герпеса, ВИЧ; реакция ДНК-ДНК гибридизации (применение ДНК-зондов, выявляющих у микробов гены резистентности; ДНК-зонды метятся радиоактивной, люминесцентной или ферментной меткой). 5. Побочные эффекты применения антбиотиков и принципы рациональной антибактериальной терапии. Использование антибиотиков может привести как к возникновению нежелательных последствий со стороны организма человека, так и к изменению свойств микроорганизмов. Со стороны организма хозяина могут возникнуть осложнения: 1) токсические реакции: - гепатотоксическое действие (при использовании тетрациклина, эритромицина и др.); - нефротоксическое действие (при использовании аминогликозидов); - нарушение костного скелета и эмали зубов (при действии тетрациклинов); - поражение органов кроветворения (при действии левомецитина, сульфаниламидов); - нарушение синтеза витамина К (при использовании цефалоспоринов); 2) дисбиозы (при использовании антибиотиков широкого спектра действия); 3) аллергические реакции (чаще при использовании пенициллинов, цефалоспоринов); 4) иммунодепрессивное состояние: - угнетение антителообразования (при действии левомицетина); - подавление фагоцитоза (при действии тетрациклинов). Изменения микроорганизмов, вызванные антибиотиками: 1) появление атипичных форм микроорганизмов (например, L- форм); 2) формирование антибиотикоустойчивости. Общие принципы рациональной антибиотикотерапии инфекционных заболеваний I. Микробиологический принцип: 1) забор клинического материала проводят с целью выявления возбудителя заболевания до начала антибиотикотерапии (для бактериологического определения чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам); 2) если была начата эмпирическая химиотерапия, то при получении данных о возбудителе из бактериологической лаборатории выбор препарата может быть пересмотрен, если возбудитель не чувствителен или мало чувствителен к используемому антибиотику. II. Фармакологический принцип: 1) доза препарата, путь введения и интервал между ними должен быть таким, чтобы в крови и местах локализации инфекции постоянно поддерживалась концентрация, превышающая минимальную подавляющую (МПК) или минимальную бактерицидную (МБК) в 4-8 раз. При первом введении химиотерапевтических средств используют ударную дозу для более быстрого создания МПК или МБК. Несоблюдение данного принципа приводит к формированию штаммов возбудителей, резистентных к лекарственным средствам; 2) продолжительность лечения должна быть оптимальной, приводить не только к полному клиническому выздоровлению, но и к полному выведению микробов из организма. Слишком быстрая отмена препарата способствует возникновению и формированию устойчивых штаммов микроорганизмов. III. Клинический принцип: 1) при назначении препарата учитывают общее состояние больного, возраст, пол, наличие беременности, сопутствующие заболевания; 2) необходимо комбинировать химиотерапевтические средства с другими лекарственными препаратами, которые способствуют повышению иммунологической резистентности организма; 3) целесообразно использовать комбинации препаратов с разными механизмами действия на микроорганизмы; 4) нельзя назначать препараты, оказывающие токсическое действие, направленное на один орган или систему. IV. Эпидемиологический принцип: при подборе антибиотика необходимо знать, к каким препаратам устойчивы микробы в среде, окружающей больного (в отделении, географическом регионе), насколько часто встречаются антибиотикорезистентные штаммы. Основные правила, соблюдение которых предупреждает развитие антибиотикорезистентности у бактерий: применять антибиотики строго по показаниям; избегать их использование с профилактической целью; через 7-10 дней антибиотикотерапии проводить смену препарата, учитывая, что у микробов существует перекрестная устойчивость к антибиотикам одного класса; по возможности использовать антибиотики узкого спектра действия; через определенное время производить смену антибиотика не только в отделении, больнице, но и в регионе; ограниченно применять антибиотики в ветеринарии; использовать ингибиторозащищенные антибактериальные препараты. |