Микробиологическая лаборатория. Техника безопасности при работе с культурой патогенных микробов и газом. Иммерсионный микроскоп.. 1 занятие. 1. Значение микробиологии для врача

Название	1. Значение микробиологии для врача
Анкор	Микробиологическая лаборатория. Техника безопасности при работе с культурой патогенных микробов и газом. Иммерсионный микроскоп
Дата	23.03.2023
Размер	218.95 Kb.
Формат файла
Имя файла	1 занятие.docx
Тип	Документы #1010079

1. Значение микробиологии для врача.

Предметом изучения МЕДИЦИНСКОЙ микробиологии являются болезнетворные (патогенные) и условно-патогенные для человека микроорганизмы, а также разработка методов микробиологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения вызываемых ими инфекционных заболеваний.

2. Роль медицинской микробиологии в снижении заболеваемости инфекционными заболеваниями.

В истории медицины нередко случалось, что какая-либо из дисциплин становилась ведущей для всего комплекса медицинских знаний. Конец XIX и начало XX в. ознаменовались такого рода гегемонией медицинской микробиологии. Одновременно с её бурным развитием формировалась иммунология (сначала как раздел, изучающий механизмы специфической защиты организма от патогенных микроорганизмов) и, несколько позднее, санитарная микробиология. Последняя изучает санитарно-микробиологическое состояние окружающей среды, её влияние на здоровье человека и разрабатывает мероприятия, предупреждающие неблагоприятные воздействия болезнетворных микробов. На современном этапе к особым разделам медицинской микробиологии относят клиническую микробиологию (её объекты - условно-патогенные микроорганизмы, вызывающие поражения человека) и фармацевтическую микробиологию, изучающую микробы, вызывающие порчу лекарственного сырья, обсеменяющие лекарственные средства (ЛС), а также технологию получения различных лекарственных и диагностических препаратов из микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

3. Назначение бактериологической лаборатории, принципы организации.

Бактериологическая лаборатория− научно-практическое учреждение, выполняющее бактериологические, иммунологические и другие микробиологические исследования.

Микробиологическая лаборатория в зависимости от ее профиля выполняет бактериологические, вирусологические и иммунологические исследования. В соответствии с назначением, лаборатория должна быть оснащена соответствующей аппаратурой и помещением. Лаборатория должна располагаться в отдельном здании или изолированной его части, оборудована водопроводом, канализацией, отоплением, горячим водоснабжением и иметь отдельный вход. Микробиологическая лаборатория общего назначения должна иметь следующие комнаты:

Лабораторные
Автоклавную
Средоварочную
Бактериологическую с боксами
Моечную
Виварий
Подсобные помещения (душ, склад, гардероб, туалет)

4. Правила поведения в бактериологической лаборатории.

Правила работы и поведения в бактериологической лаборатории общего назначения

В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды – халата, шапочки, сменной обуви.
Запрещается в помещении прием и хранение пищи. Курение.
Нельзя использовать лабораторную спец. одежду за пределами лаборатории.
Зараженный материал подлежит уничтожению, инструменты и поверхность рабочего стола, дезинфицируют после окончания работ.
После работы с культурой, животными, перед уходом из лаборатории необходимо вымыть руки.
Штаммы микроорганизмов, заразный материал должны хранится в сейфе или холодильнике закрытыми и опечатанными.
Необходимо проводить обеззараживания предметов, одежды, стола, комнаты, в случае если разбился сосуд с инфицированным материалом или произошел неосторожный разлив заразного материала.
Сотрудники лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных заболеваний, с возбудителями которых возможна работа в лаборатории.
В лаборатории должна быть инструкция по технике безопасности, которую персонал должен знать и строго выполнять. Необходимо обязательно немедленно сообщить руководителю лаборатории обо всех аварийных ситуациях, создающих угрозу биологической безопасности и проводить все мероприятия для предотвращения последствий.
Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь лицензию на право работы с возбудителями.

5.   Какой режим работы в бактериологической лаборатории?

Работники бактериологической лаборатории должны постоянно помнить при работе с инфекционным материалом о возможности заразиться и перенести инфект за пределы лаборатории. Поэтому они должны быть особенно внимательны, опрятны и педантичны в работе.

В бактериологических лабораториях нужно соблюдать следующие правила и режим работы:

1. Находиться в помещении бактериологической лаборатории, а тем более работать обязательно в халате, шапочке (косынке), в отдельных случаях в маске и резиновых перчатках.

2. Без надобности переходить из одного помещения лаборатории в другое нельзя. При выходе из лаборатории халат и другую спецодежду следует снимать. Руки обязательно вымыть с мылом.

3. Особо опасные работы проводить в специальных боксах, облучаемых после их проведения бактерицидными лампами.

4. Для работы пользоваться только отведённым местом и оборудованием. Перекладывать заразный материал или предметы, соприкасающиеся с ним, на другое рабочее место (стул, подоконник и т.д.) запрещается.

5. Все лишние предметы не следует держать на рабочем месте. Сумки, тетради, книги должны быть спрятаны в стол или целлофановые мешки.

6. Категорически запрещается курить и принимать пищу в лаборатории.

7. После завершения работы в лаборатории рабочее место и руки дезинфицируются и моются с мылом.

6.   Микроскопические методы исследования микроорганизмов: иммерсионная микроскопия, фазово-контрастная микроскопия, аноптральная микроскопия, поляризационная микроскопия.

На сегодняшний день наиболее используемой является световая микроскопия.

Иммерсионная микроскопия представляет собой метод микроскопического исследования, при котором объектив погружают в жидкость, нанесенную на исследуемый препарат.

Фазово-контрастная микроскопия основаны на явлениях преломления и дифракции видимого света. Основным достоинством этих способов микроскопирования является возможность наблюдать живые клетки и их движение.

Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца

Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).

7.   Темнопольная микроскопия, люминесцентная микроскопия, электронная микроскопия.

Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне

Люминесцентная микроскопия - метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами

Электронная микроскопия – это совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов (ЭМ) – приборов, в которых для получения увеличенного изображения используют электронный пучок, пучка электронов с энергией

8.   Принципы работы с иммерсионной системой микроскопа.

Иммерсионная микроскопия (от лат. immersio — погружение) — метод микроскопического исследования малых объектов с помощью погружения объектива светового микроскопа в среду с высоким коэффициентом преломления, расположенную между микроскопическим препаратом и объективом.

Для проведения исследований используют специальные иммерсионные объективы (объективы для масляной иммерсии имеют чёрную полосу на оправе, вблизи от фронтальной линзы; объективы для водной иммерсии — белую полосу).

9.  Последовательность действий при иммерсионной микроскопии.

Правила работы с иммерсионной системой:

1.    установить микроскоп на малое увеличение;

2.    навести максимальную освещенность (зеркало, конденсор, диафрагма);

3.    установить препарат на столик;

4.    нанести каплю масла на препарат;

5.    установить иммерсионный объектив;

6.    опустить объектив в каплю масла при помощи макровинта;

7.    наблюдая в окуляр вращать макровинт до появления изображения;

8.    микровинтом установить более четкое изображение;

9.    провести микроскопию мазка с описанием морфологических свойств;

10. поднять тубус вверх, снять препарат и очистить объектив от масла;

11. установить  микроскоп в нейтральное положение (малое увеличение, тубус вниз).

10. Основные принципы классификации микроорганизмов.

Все микроорганизмы подразделяют на три группы: высшие про-тисты (водоросли, грибы, простейшие);низшие протисты (эубак-терии, архебактерии, риккетсии и сине-зелёные водоросли) и неклеточные формы(прионы, вироиды и вирусы). Лишь ничтожная их часть в процессе эволюции приспособилась к паразитизму в организмах животных и человека. Микроорганизмы, способные вызывать инфекционные заболевания у человека, разделяют на пять основных типов: прионы, вирусы, бактерии, грибы и простейшие.

11. Формы бактерий: кокковидные бактерии, палочковидные формы бактерий, извитые (спиралевидные) бактерии, нитевидные формы бактерий.

Сферические формы, или кокки — шаровидные бактерии размером 0,5—1 мкм, которые по взаимному расположению делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины и стафилококки. Микрококки (от греч. micros — малый) — отдельно расположенные клетки. Диплококки (от греч. diploos — двойной), или парные кокки, располагаются парами (пневмококк, гонококк, менингококк), так как клетки после деления не расходятся. Пневмококк (возбудитель пневмонии) имеет с противоположных сторон ланцетовидную форму, а гонококк (возбудитель гонореи) и менингококк (возбудитель эпидемического менингита) имеют форму кофейных зерен, обрашенных вогнутой поверхностью друг к другу. Стрептококки (от греч. streptos — цепочка) — клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления. Сарцины (от лат. sarcina — связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 кокков и более, так как они образуются при делении клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Стафилококки (от греч. staphyle — виноградная гроздь) — кокки, расположенные в виде грозди винограда в результате деления в разных плоскостях.

Палочковидные бактерии различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина клеток 1 — 10 мкм, толщина 0,5—2 мкм. Палочки могут быть правильной Морфология и классификация микробов 33 (кишечная палочка и др.) и неправильной булавовидной (коринебактерии и др.) формы. К наиболее мелким палочковидным бактериям относятся риккетсии. Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная бацилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузобактерии) или в виде утолщения. В последнем случае палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии). Слегка изогнутые палочки называются вибрионами (холерный вибрион). Большинство палочковидных бактерий располагается беспорядочно, так как после деления клетки расходятся. Если после деления клетки остаются связанными общими фрагментами клеточной стенки и не расходятся, то они располагаются под углом друг к другу (коринебактерии дифтерии) или образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла).

Извитые формы — спиралевидные бактерии, которые бывают двух видов: спириллы и спирохеты. Спириллы имеют вид штопорообразно извитых клеток с крупными завитками. К патогенным спириллам относятся возбудитель содоку (болезнь укуса крыс), а также кампилобактерии и хеликобактерии, имеющие изгибы, напоминающие крылья летящей чайки. Спирохеты представляют тонкие длинные извитые бактерии, отличающиеся от спирилл более мелкими завитками и характером движения. Особенность их строения описана ниже.

Ветвящиеся — палочковидные бактерии, которые могут иметь разветвление в форме латинской буквы Y, встречающиеся у бифидобактерий, также быть представленными в виде нитевидных разветвленных клеток, способных переплетаться, образуя мицелий, что наблюдается у актиномицет.

12. Строение бактериальной клетки: клеточная стенка и её строение.

13. Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий.

Подразделение бактерий по особенностям строения клеточной стенки связано с возможной вариабельностью их окраски в тот или иной цвет по методу Грама. Согласно этому методу, предложенному в 1884 г. датским ученым X. Грамом, в зависимости от результатов окраски бактерии делятся на грамположительные, окрашиваемые в сине-фиолетовый цвет, и грамотрицательные, окрашиваемые в красный цвет.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Основную массу стенки составляет пептидогликан

14. Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий. J-трансформация бактерий.

Впервые эта форма изменчивости бактерий была описана в 1935 г. Е. Клинебергер. Она обнаружила и выделила из культуры Streptobacillus moniliformis необычные варианты, которые росли в виде маленьких характерных колоний с врастающей в агар центральной и фестончатой полупрозрачной периферической зонами. В этих колониях обнаруживались самые разнообразные по морфологии структуры: нитевидные, волокнистые, колбасовидные, шаровидные образования и мелкие гранулы размером 0,1 – 0,15 мкм (фильтрующиеся формы бактерий). Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, а такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией

15. Цитоплазматическая мембрана бактерий, цитоплазма.

Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану. По структуре она похожа на плазмолемму клеток животных и состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов, с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. В отличие от эукариотических клеток, в цитоплазматической мембране бактериальной клетки отсутствуют стеролы. Цитоплазматическая мембрана окружает наружную часть цитоплазмы бактерий и участвует в регуляции осмотического давления, транспорте веществ и энергетическом метаболизме клетки. При избыточном росте цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Роль мезосом и внутрицитоплазматических мембран до конца не выяснена. Предполагают даже, что они являются артефактом, возникающим после приготовления (фиксации) препарата для электронной микроскопии. Тем не менее считают, что производные цитоплазматической мембраны участвуют в делении клетки, обеспечивая энергией синтез клеточной стенки, принимают участие в секреции веществ, спорообразовании, т.е. в процессах с высокой затратой энергии.

Цитоплазма занимает основной объем бактериальной клетки и состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул — рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер около 20 нм и коэффициент седиментации 70S, в отличие от SOS-рибосом, характерных для эукариотических клеток. Поэтому некоторые антибиотики, связываясь с рибосомами бактерий, подавляют синтез бактериального белка, не влияя на синтез белка эукариотических клеток. Рибосомы бактерий могут диссоциировать на две субъединицы: 50S и 30S. рРНК — консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S-pPHK входит в состав малой субъединицы рибосом, a 23S-pPHK — в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяя оценить степень родства организмов. В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов. Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей.

16. Капсулы, жгутики, споры – их назначение и выявление.

Капсула — слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. Она выявляется при специальных методах окраски мазка по Бурри— Гинсу, создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Капсула состоит из полисахаридов, иногда из полипептидов, например у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Она препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела к капсуле вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы). Многие бактерии образуют микрокапсулу — слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слизь — мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких внешних границ. Капсула и слизь предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, так как, являясь гидрофильными, хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизма и бактериофагов.

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12—20 нм, длина 3—15 мкм. Они состоят из трех частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (одна пара дисков у грамположительных и две пары у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем — ротором, вращающим жгутик. В качестве источника энергии используется разность протонных потенциалов на цитоплазматической мембране. Механизм вращения обеспечивает протонная АТФ-синтетаза. При наличии у бактерии нескольких жгутиков они начинают синхронно вращаться, сплетаясь в единый пучок, образующий своеобразный пропеллер. Жгутики состоят из белка — флагеллина, являющегося антигеном — так называемый Н-антиген. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали. Число жгутиков у бактерий разных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен, отходящих по периметру бактерии (перитрих), у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки. Жгутики выявляют с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами, или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанными на протравливании и адсорбции различных веществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков (например, после серебрения).

Споры — своеобразная форма покоящихся бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Спорообразующие бактерии рода Bacillus, у которых размер споры не превышает диаметр клетки, называются бациллами. Спорообразуюшие бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, отчего они принимают форму веретена, называются клостридиями, например бактерии рода Clostridium (от лат. Clostridium — веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля—Нельсена в красный, а вегетативная клетка — в синий цвет. Процесс спорообразования (споруляция) проходит ряд стадий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома бактериальной вегетативной клетки отделяются, окружаясь врастающей цитоплазматической мембраной, — образуется проспора. Споры некоторых бактерий имеют дополнительный покров — экзоспориум липопротеиновой природы. Таким образом формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем и формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. Спора приобретает термоустойчивость, которую связывают с наличием в ней дипиколината кальция. Спора долго может сохраняться из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизма. В почве, например, возбудители сибирской язвы и столбняка могут сохраняться десятки лет. В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три последовательные стадии: активации, инициации, вырастания. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация — это готовность к прорастанию. При температуре 60—80 °С спора активируется для прорастания. Инициация прорастания длится несколько минут. Стадия вырастания характеризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки и выходом проростка.