Документ Microsoft Word (3). 2. Жизненный цикл
 Скачать 34.96 Kb.
|
|
Фаг λ (бактериофаг λ, Колифаги λ) - умеренный бактериофаг кишечной палочки (Escherichia coli). Модельный организм генетики, молекулярной биологии и биологии бактериофагов. В жизненном цикле фаг лямбда должен сделать один большой "выбор" - каким путем ему развиваться: литическим, при котором клетка- живителя программируется на производство новых фаговых частиц, а затем погибает, высвобождая в среду вирусное потомство, или лизогенная, заключающийся во встраивании фагового генома в хромосому бактерии, где он может находиться длительное время и передаваться следующим поколениям E.coli. Этот выбор осуществляется на основе относительно простого механизма переключения генов, что сделало фаг лямбда удобным объектом для изучения регуляции генной экспрессии. Этот вирус является одним из наиболее детально изученных живых организмов на Земли. Как и любой умеренный бактериофаг фаг λ способен к специализированной трансдукции - переноса генов одной клетки живителя к другой. Это его свойство позволило использовать фаг λ с целью конструирования одних из первых векторных молекул для клонирования генов. Их усовершенствованные версии используются генетиками и молекулярными биологами до сих пор. 1. Строение Вирион фага λ состоит из икосаэдрической головки диаметром около 50 нм и хвостового отростка длиной около 150 нм, на конце которого расположены боковые нити длиной 85 нм. [1] В общем, в состав белковой оболочки фага входит около пятнадцати белков, кодируемых вирусным геномом. Наследственная информация представлена двухниточным линейной ДНК размером 48502 П.Н.. с однониточной взаемнокомплементарнимы ("липкими") концами по 12 нуклеотидов. В геноме фага λ выявлено 75 открытых рамок считывания. [3] 2. Жизненный цикл Жизненный цикл фага лямбда Фаг лямбда относится к умеренных бактериофагов. В отличие от вирулентных или литических бактериофагов, которые после инфекции обязательно превращают клетки в "фабрику" продуцирования новых вирионов, а затем разрушают ее, умеренные фаги имеют выбор: при благоприятных условиях они развиваются литическим путем, то есть ведут себя подобно вирулентных, а в условиях недостатка энергетических ресурсов может реализоваться другой - лизогенная путь развития, когда фаг превращается в латентную "дремлющую" форму - профаг. При определенных условиях профаг может включаться и переходить к литической развития, такой переход называется индукцией профага. [4] При инфицирования кишечной палочки бактериофаг сначала адсорбируется на ее поверхности, после чего вводит в цитоплазму свою ДНК. В клетке происходит экспрессия небольшой части вирусных генов, необходимых для принятия решения, каким путем следует развиваться. Если фаг "выбрал" литический путь, большинство его генов активируются, и около 45 минут в бактерии собирается около 100 новых вирионов, которые выходят в среду разрушая клетку живителя. [2] Зато во время лизогенного развития вирусная ДНК встраивается в бактериальную хромосому, превращая такую клетку на лизогенная (т.е. такую, которая при определенных условиях может стать причиной лизиса других клеток в культуре). После этого из всего вирусного генома экспрессируется только один ген - белка репрессора, который подавляет работу остальных генов. Во время каждого цикла репликации бактериальной ДНК реплицируется и профаг и каждая дочерняя клетка получает свою копию. В таком состоянии бактериофаг лямбда может находиться неограниченное время. Лизогенизации клетки имеет еще одно следствие: из-за того, что в ее цитоплазме всегда есть определенный уровень белка репрессора, она не может повторно инфицироваться фагом того же типа. Спонтанная индукция профага, т.е. его переход к литической развития, является очень редким событием, и происходит примерно в одной из миллиона лизогенных клеток, этим объясняется низкий уровень вирусных частиц в лизогенных культурах. Однако частоту индукции можно повысить почти до 100% путем облучения бактерий небольшой дозой ультрафиолета. В таком случае в клетках включается SOS-ответ, призвана обеспечить репарацию повреждений ДНК. Белок-репрессор реагирует на запуск SOS-ответа в клетке самоуничтожением, следствием дерепрессия других генов фага, вырезание (эксцизии) его генома с бактериальной хромосомы, и запуск литического развития. С эволюционной точки зрения, это "умное" решение, поскольку SOS-ответ может означать, что клетка живителя имеет серьезные неприятности, и лучше ее покинуть. [5] Умеренный бактериофаг р1. Данный фаг репродуцируется в клетках E. coli и является одним из наиболее крупных бактериальных вирусов. Литический цикл фага р1 тоже напоминает таковой фага Т4, за исключением того что для адсорбции он нуждается в ионах кальция – это так называемый кофактор адсорбции. Кофактором адсорбции фага Т4 служит триптофан. Точно так же как в случае продукции фага Т4, при литическом цикле репродукции фага р1 формируется конкатемеры, которые потом нарезаются и упаковываются примерно по тому же способу как и геномы фага Т4. Ну в отличие от фага Т4, репродукция фага р1 не приводит к резкому ингибированию синтеза ДНК клетки хозяина. В случае репродукции фага Т4 имеет место быстрая деградация генома клетки и использование продуктов деградации для синтеза фаговой ДНК. Особенностью фага р1 является то, что в состоянии лизогенизации его геном не встраивается в геном клетки, а находится автономно от хромосомы бактерии и реплицируется отдельно от репликации хромосомы. Но эта репликация относится к категории строгой репликации, ибо она зависит каким-то образом от репликции хромосомы клетки хозяина. Таким образом на каждую хромосому приходится одна-две копии генома фага р1. Таким образом, данный фаг на стадии литического цикла развития ведет себя как плазмида, находится в автономном от хромосомы состоянии. Не смотря на это, при делении клетки имеет место четкое распределение копий генома данного фага. Каков механизм обеспечивающий такую сегрегацию толком не известно, но во всяком случае этот фаг описывается как фаг-плазмида. Он характеризуется особыми формами трансдукции тех или иных генов. Определенный интерес представляет ещё бактериофаг репродуцирующийся в клетках Bacillus subtilis и обозначаемый как РBS1. Этот фаг пока считается самым крупным из изученных в настоящее время. В морфологическом плане организован довольно сложно: обладает хвостовым отростком и спиральными хвостовыми нитями, прикрепленные на дистальном конце хвостового отростка. Фаг имеет сократительный наружный чехол. Особенностью данного фага является то, что он способен заражать только подвижные клетки, т к адсорбционными зонами клетки хозяина являются жгутики и своими нитями фаг адсорбируются на жгутиках и потом передвигается по жгутикам к основанию жгутика, где и инфицируют клетку. Ну, инфекция осуществляется так же, как инфекция Т-четными фагами, имеется фаговый лизоцим – ДНК проникает внутрь клетки. Жгутики должны быть в движении и адсорбция данного фага на подвижных клетках лишает их способности двигаться, т.е. подвижность ингибируется. ДНК бактериофага, данного вируса, является уникальной в том плане, что у неё вместо тимина содержится урацил, это довольно редкое, конечно, явление в области химических составов дезоксирибонуклеиновых кислот. Крупный размер фага PBS1 предопределяют наличие довольно большого объема генетической информации, позволяющей кодировать различные структурные белки-продукты, в частности, помимо фермента, который обеспечивает включение урацила вместо тимина в ДНК. Данный фаг детерминирует синтез других белковых, в частности у этого фага есть собственная РНК-полимераза, обеспечивающая транскрипцию его генов, что доказывается таким фактом, что фаг PBS1 репродуцируется в клетках с заблокированной активностью клеточной РНК-полимеразы. Но транскрипция генов фага осуществляется, значит, это говорит о том, что функционирует собственная РНК-полимераза. Физические исследования показали, что большая часть, если не вся ДНК фага PBS1, находиться в виде плазмиды, т.е. тоже может быть … фаг может быть отнесен к фагам-плазмидам и не встраивается в хромосому клетки. Ещё один интересный факт свойственный данному фагу, при лизогенизации клетки имеет место состояние псевдолизогенности. Этот термин подразумевает следующее: для поддержания лизогенного состояния в клетках инфицированных фагом PBS1 требуются постоянное дополнительные инфицирование этих клеток этим же фагом. Если из внешней среды фаг удаляется - PBS1, то в клетке состояние лизогенезации прекращается, клетка становится свободной от фага. Поэтому для поддержания лизогенного состояния требуется постоянное проникновение в эту клетку новых фаговых геномов. Вот это состояние получило название – состояние псевдолизогенности или псевдолигзогенизации. Интересно и то, что данное состояние псевдолизогенности свойственно и спорам Bacillus subtilis, т.е. генетическая информация определенной части генетической части данного фага передается из вегетативной клетки в образующуюся спору и прорастая из споры образует клетку в состоянии лизогенности, которая требует, опять же, дополнительного заражения фагом PBS1 для поддержания умеренного фага в состоянии профага. M13 bacteriophage From Wikipedia, the free encyclopedia [hide]This article has multiple issues. Please help improve it or discuss these issues on the talk page. (Learn how and when to remove these template messages) This article possibly contains original research. (May 2012) This article needs additional citations for verification. (May 2012) M13 bacteriophage M13B.svg Blue: Coat Protein pIII; Brown: Coat Proteín pVI; Red: Coat Protein pVII; Limegreen: Coat Protein pVIII; Fuchsia: Coat Proteín pIX; Purple: Single Stranded DNA Virus classification Group: Group II (ssDNA) Family: Inoviridae Genus: Inovirus Species Enterobacteria phage M13 M13 is a virus that infects the bacterium Escherichia coli. It is composed of a circular single-stranded DNA molecule encased in a thin flexible tube made up of about 2700 copies of a single protein called P8, the major coat protein. The ends of the tube are capped with minor coat proteins. Infection starts when the minor coat protein P3 attaches to the receptor at the tip of the F pilus of the bacterium. Infection with M13 is not lethal; however, the infection causes turbid plaques in E. coli because infected bacteria grow more slowly than the surrounding uninfected bacteria. It engages in a viral lifestyle known as a chronic infection which is neither lytic nor temperate. However a decrease in the rate of cell growth is seen in the infected cells. M13 plasmids are used for many recombinant DNA processes, and the virus has also been studied for its uses in nanostructures and nanotechnology. Phage particles[edit] The phage coat is primarily assembled from a 50 amino acid protein called pVIII (or p8), which is encoded by gene VIII (or g8) in the phage genome. For a wild type M13 particle, it takes approximately 2700 copies of p8 to make the coat about 900 nm long. The coat's dimensions are flexible though and the number of p8 copies adjusts to accommodate the size of the single stranded genome it packages. For example, when the phage genome was mutated to reduce its number of DNA bases (from 6.4 knt to 221 nt),[1] then the number of p8 copies was decreased to fewer than 100, causing the p8 coat to shrink in order to fit the reduced genome. The phage appear to be limited at approximately twice the natural DNA content. However, deletion of a phage protein (p3) prevents full escape from the host E. coli, and phage that are 10-20X the normal length with several copies of the phage genome can be seen shedding from the E. coli host. There are four other proteins on the phage surface, two of which have been extensively studied. At one end of the filament are five copies of the surface exposed pIX (p9) and a more buried companion protein, pVII (p7). If p8 forms the shaft of the phage, p9 and p7 form the "blunt" end that is seen in the micrographs. These proteins are very small, containing only 33 and 32 amino acids respectively, though some additional residues can be added to the N-terminal portion of each which are then presented on the outside of the coat. At the other end of the phage particle are five copies of the surface exposed pIII (p3) and its less exposed accessory protein, pVI (p6). These form the rounded tip of the phage and are the first proteins to interact with the E. coli host during infection. p3 is also the last point of contact with the host as new phage bud from the bacterial surface. Replication in E. coli[edit] Below are steps involved with replication of M13 in E. coli. Viral (+) strand DNA enters cytoplasm Complementary (-) strand is synthesized by bacterial enzymes DNA Gyrase, a type II topoisomerase, acts on double-stranded DNA and catalyzes formation of negative supercoils in double-stranded DNA Final product is parental replicative form (RF) DNA A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral strand pII circulizes displaced viral (+) strand DNA Pool of progeny double-stranded RF molecules produced Negative strand of RF is template of transcription mRNAs are translated into the phage proteins Лизогения Лизогения — это совместное существование бактерий и бактериофагов, при котором бактериофаг является составной частью нормально развивающейся бактериальной клетки. При лизогении нуклеиновая кислота бактериофага включается в состав хромосомы бактерии и воспроизводится вместе с ней. Образуются белки, придающие бактерии-хозяину ряд новых свойств, например меняют ее вирулентность, чувствительность к антибиотикам или другим бактериофагам. Фаговые частицы не образуются. См. также Бактериофаг, Генетика (микроорганизмов). Лизогения (от греч. lysis — распад, разрушение и gennao — создаю, произвожу) — наследуемое свойство бактериальной клетки образовывать инфекционный бактериофаг и выделять его в окружающую среду. Бактериальные культуры, обладающие этим свойством, называют лизогенными. Явление лизогении открыли Львов (A. Lwoff) и Гутманн (A. Gutmann), которые показали, что индивидуальные клетки Вас. megaterium многократно делятся без выделения фага, но после 19-го деления дочерняя бактерия лизируется, выделяя при этом активный фаг (см. Бактериофаг). Обнаружить активный фаг или фаговые антигены внутри лизогенной бактерии пока не удалось. Установлено, что в лизогенной бактерии бактериофаг находится в особой форме, отличающейся от зрелого фага. Эта форма, которую Львов назвал профагом, представляет собой ДНК фага, объединенную с ДНК бактерии. Таким образом, состояние лизогении — пример объединения генетического аппарата вируса (фага) с хромосомой хозяина (бактерии). Профаг непатогенен для бактериальной клетки и репродуцируется одновременно с бактериальной хромосомой. Летальным для бактерии оказывается лишь превращение профага в зрелый фаг. Способность вызывать состояние лизогении у бактерий присуща определенным, так называемым умеренным, фагам. Инфекция бактериальной клетки таким фагом, завершающаяся установлением состояния лизогении, называется редуктивной, в отличие от продуктивной, заканчивающейся размножением фага и лизисом клетки. Лизогенность, приобретенная бактериями в результате заражения умеренным фагом,— весьма стойкое свойство, сохраняющееся в течение многих лет. Однако возможна реверсия лизогенных клеток к нелизогенности. Умеренные фаги, лизогенизирующие бактерию, объединены с ее хромосомой, как правило, в определенных участках. Так, например, фаг λ локализован в хромосоме Е. coli К12 рядом с геном, контролирующим расщепление галактозы, а фаг 080 сцеплен с генами синтеза триптофана. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет к повторному заражению гомологичным фагом. Доказано, что эта форма иммунитета клетки обусловлена неспособностью ДНК суперинфицирующего фага индуцировать в клетке синтезы, приводящие к формированию фаговых белков и ДНК. Превращение профага в вегетативный, а затем в зрелый фаг называют индукцией. Этот процесс может происходить спонтанно или же под влиянием внешних факторов, из которых наиболее активным является ультрафиолетовое облучение. Механизм индукции еще точно не изучен, но известно, что в результате его хромосома фага оказывается автономной, не связанной с хромосомой бактерии, и в клетке начинается синтез частиц фага. Особый интерес представляет то, что большинство индуцирующих агентов является мутагенами (см. Мутация), а многие из них — канцерогенами (см. Канцерогенные вещества). В ряде случаев лизогенизация бактерий сопровождается изменением (конверсия) некоторых ее свойств. Например, описаны умеренные дифтерийные фаги, лизогенизация которыми обусловливает появление у дифтерийной палочки токсигенности. Плазмиды агробактерий В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium эволюционно родственны клубеньковым бактериям, относящимся к роду Rhizobium, и имеют много общих с ними черт. Однако характер взаимодействия агробактерий с растением имеет своеобразные особенности. Взаимодействие видов Agrobacterium с растениями представляет особый интерес, так как при этом виде паразитизма один из партнеров специфически видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном. Кроме того, это служит уникальным примером миграции ДНК прокариот в эукариотическую клетку. ДНК митохондрий и хлоропластов Хлоропласты и митохондрии содержат полноценную генетическую систему, то есть все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации: ДНК, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и белоксинтезирующий аппарат (рибосомы, т-РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы). 6.Хлоропластная и митохондриальная ДНК также привлекают внимание ученых в качестве возможных векторов для переноса генов в клетку. Структурная организация этих клеточных субгеномов существенно различается. Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой генетической информацией, так называемым пластомом. У высших растений он представляет собой замкнутую молекулу ДНК длиной 150 т. н. п., достаточную для кодирования примерно 100 белков. Для синтеза пластид необходимо значительно больше белков. Остальные белки кодируются ядром, синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты. Некоторые важнейшие белки хлоропластов состоят из нескольких субъединиц, часть из них синтезируется на рибосомах цитоплазмы и транспортируется в хлоропласт, где они объединяются с другими полипептидами, закодированными в самом хлоропласте и там же синтезируемыми. Таким образом, для биосинтеза функционально активного хлоропласта требуется согласованная экспрессия генома и пластома. Различные типы пластид содержат неодинаковые количества идентичных копий пластома: от 10 – 20 копий в пластидах корней и зрелых хлоропластах до сотен копий в молодых хлоропластах картофеля. Такой уровень амплификации позволяет надеяться на надежную экспрессию чужеродной ДНК при использовании их в качестве векторов в генноинженерных экспериментах. Кроме того, гены рибосомальной РНК пластид и большой субъединицы РБФК кодируются геномом хлоропластов. Возможно, введение сильных промоторов в эти гены и дополнительная их модификация существенно повлияют на фотосинтетическую активность растительной ткани. Гены растений также способны к экспрессии в клетках Е. coli. Это гены большой субъединцы РБФК. Преимущество хлоропластных генов заключается в том, что их экспрессия к клетках кишечной палочки может быть достигнута путем простого объединения транскрибируемых последовательностей, т.к. в ДНК хлоропластов и бактерий до начала стартовых кодонов трансляции расположена одинаковая нуклеотидная последовательность. Это дает возможность синтезировать растительные экономически важные полипептиды с помощью клеток прокариот. В отличие от хлоропластной, ДНК митохондрий характеризуются исключительным разнообразием и их величина колеблется от 200 до 2400 т. н. п.. Однако никакой корреляции между размером митохондриального генома и числом белковых продуктов, синтезируемых изолированными митохондриями, не наблюдается. Это явление, а также большие размеры митохондриальной ДНК, по-видимому, можно объяснить присутствием ДНК, бесполезной для функционирования митохондрий. В составе митохондриальной ДНК имеются структурные гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется ядерными генами. Но если геном хлоропластов представлен гомогенной популяцией крупных кольцевых молекул, то в митохондриях содержится несколько классов кольцевых молекул, не все функции которых еще ясны. Митохондриальный геном животных организмов намного меньше, 15 – 19 т. н. п., и более консервативен по структуре. Гены митохондрий кодируют 2 группы признаков – работу дыхательных систем и устойчивость к антибиотикам и другим ядам. В митохондриальном геноме растений есть также гены, отвечающие за признак мужской стерильности цитоплазмы. Транспозоны Транспозоны - сегменты ДНК, которые контролируют собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. Впервые были открыты в 40-х годах американской ученой Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Эти гены, индентифицированные по их способности подавлять экспрессию других генов кукурузы, находящихся рядом с ними, не имели фиксированного положения в хромосоме. Они как бы передвигались по всему геному растения. Регуляторные элементы могли встраиваться и выщепляться, причем после их выщепления зачастую начинали функционировать ранее молчащие гены. Оказалось, что гены, ассоциированные с регуляторными элементами, становились нестабильными и часто мутировали из-за нестабильности самих этих элементов. В течение многих лет кукуруза оставалась единственной системой, в которой обнаруживались такие подвижные генетические элементы. Сейчас - и у бактерий, дрозофил и других организмов. Механизм перемещения фрагментов ДНК по геному до конца не выяснен. ДНК переносится ферментом транспозазой. Фермент кодируется последовательность длиной около 20 нуклеотидов в середине транспозона. Он специфически взаимодействует с концевыми инвертированными повторами мобильного элемента и может вырезать его из хромосомы. Вырезание может происходить точно – с восстановлением исходной структуры участка ДНК, и неточно, то есть с делециями и вставками от одного до нескольких нуклеотидов. Это приводит к появлению стабильных мутаций и является одним из механизмов создания новых последовательностей ДНК. Как правило, мобильные генетические элементы многократно повторены в геноме и образуют гетерогенные семейства, члены которых диспергированы по хромосомам. Большая часть членов каждого семейства являются дефектными копиями и не кодируют какой-либо функции, хотя сохраняют способность к перемещению. Поведение транспозонов можно расценить как паразитическое. Длина их от 2 до 10 тысяч нуклеотидных пар. У высших эукариот на долю транспозонов приходится примерно 10% ДНК клетки. Большинство их перемещается изредка, но, так как их в клетке довольно много, транспозиция оказывает значительное влияние на разнообразие видов. Биологический смысл перемещения отдельных сегментов ДНК: - прерывание соответствующего гена, что ведет к эволюции; - регуляция деятельности генов, так как транспозоны могут нести сигналы для начала считывания генов. В новых областях усиливают или запрещают работу гена. Транспозоны также участвуют в горизонтальном переносе генов. У бактерий были обнаружены 2 класса подвижных генов, различающихся по длине и сложности организации. 1. Инсерционные последовательности, или 1S элементы, имеющие длину около тысячи пар нуклеотидов и содержащие только ген, отвечающий за их перемещение. 2. Транспозоны, длиной от 3 до 20 т. н. п., состоящие из ряда дополнительных генов, отвечающих за устойчивость бактерий к различным токсическим веществам. Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. С помощью транспозируемого элемента Р дрозофиле был передан ген, обуславливающий коричневую окраску глаз. Перенос генов при помощи транспозонов имеет большие преимущества, так как он происходит с высокой частотой и не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК. Кроме того, этим методом можно переносить достаточно большие фрагменты ДНК. |