Анализ. Анализ наследования отдельных признаков у низших эукариот. Анализ наследования отдельных признаков у низших эукариот
 Скачать 97.64 Kb.
|
1 2 Анализ наследования отдельных признаков у низших эукариот. В жизненном цикле мхов, грибов, водорослей преобладает гаплоидная стадия, диплоидная стадия у большинства из них представлена зиготой, при мейотическом делении которой вновь образуются гаплоидные споры. У грибов-аскомицетов аскоспоры находятся в одной сумке-аске. Их может быть 4, как у дрожжей, или 8, как у нейроспоры и аспергилла, если после мейоза сразу происходит митоз. Они могут располагаться в аске линейно, образуя упорядоченные тетрады (или октады), например у нейроспоры, или они располагаются случайным образом, т. е. формируют неупорядоченные тетрады (октады) - дрожжи, аспергилл  Генетический анализ у низших эукариот проводится либо на случайной выборке спор, либо методом тетрадного анализа, либо путем учета митотического расщепления. Единицей учета при анализе служат клоны или штаммы - генетически однородные культуры, получаемые при бесполом размножении клеток, содержащих одно ядро. Анализ случайной выборки спор. Для количественного учета мейотического расщепления на случайной выборке спор в моногибридном скрещивании выделяют гаплоидные продукты мейоза (аскоспоры) в потомстве гибрида, полученного от скрещивания штаммов, различающихся по одному признаку (размер или форма колоний, окраска колоний, ауксотрофность по какому-либо фактору роста, устойчивость к антибиотику и др.). Для этого собирают споры, не загрязненные вегетативными гибридными клетками и клетками родительских форм. Сбор проводят по-разному у разных организмов. Спорулирующую культуру дрожжей-сахаромицетов выдерживают в спирте определенной концентрации, который убивает вегетативные диплоидные клетки, где не произошло мейоза, оставляя живыми аскоспоры. После этого смесь центрифугируют, промывают водой, помещают в раствор фермента, растворяющего оболочку асков, и таким образом разъединяют споры. У нейроспоры аскоспоры при созревании высыпаются из плодового тела. Для их сбора переворачивают чашку с культурой гриба, и споры высыпаются на крышку. Отобранные споры после соответствующего разведения в жидкой среде высевают на чашки с полной средой, где подсчитывают колонии, различающиеся по фенотипу (например, по окраске или форме колоний), и определяют их соотношение. Если исходные штаммы различаются по какому-либо биохимическому признаку (ауксотрофны по одному фактору роста), то после посева спор на чашки с полной средой выросшие на ней колонии переносят методом отпечатков на полную и минимальную среду, которая в данном случае оказывается селективной - на ней не растут мутантные клетки. Подсчитав число колоний, выросших при пересеве на полной и минимальной средах, можно определить число мутантных колоний. Оно равно разнице между числом колоний, выросших на полной среде (нормальные+мутантные), и числом колоний, выросших на минимальной среде (нормальные); затем определяют соотношение нормальных и мутантных колоний, полученное в данном опыте. Если родительские формы различаются по аллелям одного гена, например В и b, то гетерозигота после мейоза образует два типа спор - В и b - в равном количестве, и соотношение нормальных и мутантных колоний, выращенных из случайной выборки спор, должно быть в этом случае примерно 1:1. Если признак контролируется не одним, а большим числом генов, то наблюдается отклонение от этого расщепления, например 3:1. Если в потомстве аскоспор гибрида расщепление отсутствует, то можно предположить, что признак определяется цитоплазматическим фактором. Нетрудно заметить, что расщепления на случайной выборке аскоспор не отличаются от расщепления у высших эукариот в анализирующем скрещивании. 3. Тетрадный анализ Поскольку аскоспоры в аске некоторое время сохраняются вместе, можно учесть расщепление в каждой четверке спор, образовавшихся после одного мейоза (или в четырех парах спор, если аски восьмиспоровые). Такой метод учета расщеплений называется тетрадным анализом. Для разделения спор применяют микроманипулятор. Каждую из спор помещают на полную среду, на которой вырастают клоны любых генотипов. Клетки из клонов, выросших на полной среде, переносят на полную (п), минимальную (т) и селективные (с) среды и проводят учет расщеплений в каждой тетраде (октаде) спор. На дрожжах пересев проводят по определенному шаблону: на чашке в ряду представлено потомство одной тетрады, каждый штрих соответствует потомству одной споры - а, б, в, г  Если происходит расщепление по одной аллельной паре (В-b), то соотношение аскоспор во всех асках должно быть 2В:2b (или 4В:4b, если аски восьмиядерные), что служит прямым доказательством закона чистоты гамет. В тетрадном анализе не сокращают коэффициенты, т. е. не пишут 1B:1b, так как такая запись означала бы, что из 4 (или 8) аскоспор проросло только 2. Отклонения в расщеплении при моногенном контроле, как правило, редки и могут быть связаны с конверсией гена. Появление значительного количества тетрад, имеющих отклонение от расщепления 2:2 по изучаемому признаку, например 4:0,3:1, говорит об участии в расщеплении более одного гена. Другие причины отклонений - хромосомные перестройки, анеуплоидия, снижают жизнеспособность аскоспор и тем самым также влияют на расщепление. Одной из важных особенностей тетрадного анализа является возможность картирования центромеры, которая выступает в качестве генетического маркера. В упорядоченных тетрадах это можно сделать на основе расщепления по одному гену, анализируя порядок расположения спор разного генотипа (например, В и Ь) в аске, извлекая их из него по порядку. Так, у нейроспоры возможны два типа расхождения хромосом в мейозе, которые определяют порядок расположения спор в аске: расхождение в I делении мейоза (рIд) и во II делении мейоза (рIд). Если в мейозе в гетерозиготной клетке не происходит кроссинговера между центромерой и геном, например В, то расхождение аллелей (В-b) идет в I делении мейоза (рIд). Об этом будет свидетельствовать следующий порядок расположения спор в аске: BBBBbbbb или bbbbBBBB. Он зависит от ориентации хромосом бивалента в метафазе I деления  Если в мейозе между геном и центромерой происходит кроссинговер, то расхождение аллелей осуществляется во втором делении мейоза (рIIд), о чем будет свидетельствовать другой порядок расположения спор в аске, который определяется ориентацией 1 2 |