Биохимия крови
 Скачать 51 Kb.
|
|
Тема: Биохимия крови. Занятию №1. Учебные и воспитательные цели: - Общая цель: привить знания о физико-химических свойствах, химическом составе крови, роли кальция в организме. - Частные цели: - уметь определять уровень кальция в сыворотке крови. Входной контроль знаний.
Основные вопросы темы:
6. Роль кальция в организме. Регуляция уровня кальция в крови. Лабораторно-практическая работа: Определение уровня кальция в сыворотке крови. Выходной контроль. Ситуационные задачи. Литература. Биохимия под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева М.: ГЭОТАР- МЕД, 2011г Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 2004.С. 567-582. Материал лекций. Лабораторно-практическая работа. Методика определения кальция в сыворотке крови. ПРИНЦИП МЕТОДА: органические соединения-комплексоны взаимодействуют с кальцием. В качестве комплексона используется трилон Б (ЭДТА-этилендиаминтетраацетат). Трилоном Б титруют ионы кальция, предварительно связанные с мурексидом (индикатор). Комплекс кальций-мурексид имеет красно-оранжевый цвет. ХОД РАБОТЫ: свободный от кальция мурексид окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
РАСЧЕТ: 1мл 0,1 моль/л р-ра трилона Б эквивалентен 0,12 мг кальция Х= х 0,12 х 100 мг% - количество мл трилона Б, пошедшего на титрование опытной пробы. Коэффициент перерасчета: 0,2495 на ммоль/л N = 2,25 – 2,64 ммоль/л Методика определения общего белка и белковых фракций в сыворотке крови рефрактометрическим методом. ПРИНЦИП МЕТОДА состоит в том, что степень рефракции обусловлена количеством растворенных в растворе частиц. Практически коэффициент рефракции сыворотки крови довольно точно свидетельствует о количественном содержании в ней белка. ХОД АНАЛИЗА: Взять 2 пробирки для центрифугирования. В одну отмерить 0,6 мл сыворотки крови, а в другую - 0,6 мл воды. Затем той же пипеткой в обе пробирки добавить по 0,6 мл насыщенного раствора сернокислого аммония. Раствор сернокислого аммония к сыворотке крови добавляют маленькими порциями, медленно, чтобы не образовались пузырьки при этом происходит осаждение глобулина. Легкими поворотами содержимое пробирки осторожно смешивают и центрифугируют пробирку с сывороткой крови 5 мин при скорости 1000 – 1500 об/мин. Пока происходит центрифугирование сыворотки, рефрактометрируют:
Записывают результаты рефрактометрирования - показатель рефракции (НД). Рефракция солей сыворотки - величина постоянная и равна 0,002. Из отцентрифугированной сыворотки берут каплю из прозрачного верхнего слоя и также рефрактометрируют. РАСЧЕТ ДЛЯ АЛЬБУМИНОВ: НД альбуминов = (НД осажденной сыворотки - НД полунасыщенного р-ра сернокислого аммония х 2 - 0,002/ показатель рефракции солей сыворотки). 1% р-р альбуминов имеет показатель рефракции равный 0,00177, затем рассчитывают процентное содержание альбуминов: 1% - 0,00177 1х НД альб. Х% - НД альбуминов Х = 0,00177 РАСЧЕТ ДЛЯ ГЛОБУЛИНОВ: НД альбуминов = (НД неосажденной сыворотки - НД воды - НД альбуминов - 0,002). 1% р-р глобулинов имеет показатель рефракции равный 0,00229. По пропорции находят содержание глобулинов: 1% - 0,00229 1х НД глоб. Х% - НД глобулинов Х= 0,00229 По сумме альбуминов и глобулинов находят общий белок и коэффициент А/Г. 3.2. Методика определения белковых фракций методом электрофореза на бумаге. ПРИНЦИП МЕТОДА: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем 1- и 2-глобулины, далее - глобулины и наконец - глобулины. АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра. ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть. Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой. Количественное определение белковых фракций проводится с помощью денситометра или путём экстрагирования спиртовым раствором щелочи с последующим определением концентрация краски фотоколориметрически. Тема: Метаболизм гемоглобина. Занятие №1 Учебные и воспитательные цели: Общая цель: привить знания о метаболизме гемоглобина, дифференциальной диагностике различных видов желтух. Частные цели: - уметь определять концентрацию гемоглобина в крови. Входной контроль знаний.
Основные вопросы темы: 1.Строение гемоглобина. 2.Физиологические и аномальные формы гемоглобина. Серповидноклеточная анемия, талассемии, гликозилированный гемолглобин. 3.Синтез гема, гемоглобина. 4.Распад гемоглобина. Прямой (конъюгированный) и непрямой (неконъюгированный) билирубин. 5.Гемолитическая желтуха. Причины. Диагностика. 6.Желтуха новорожденных. Причины. 7.Обтурационная (механическая) желтуха. Причины. Диагностика. 8. Паренхиматозная (печеночная) желтуха. Причины. Диагностика. Лабораторно-практическая работа. Определение концентрации гемоглобина в крови. Выходной контроль. Ситуационные задачи. Литература: Биохимия под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева М.: ГЭОТАР- МЕД, 2011г. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 2004, С. 582-585, 599-607. Материалы лекций. Методика определения концентрации гемоглобина в крови. ПРИНЦИП МЕТОДА: Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидридом окрашенный гемиглобинцианид, поглощающий свет при длине волны 540 (520-560) нм. Концентрация образовавшегося гемиглобинцианида пропорциональна концентрации гемоглобина. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА: В пробирку вносят 5 мл трансформирующего раствора, затем добавляют 1 каплю крови и тщательно перемешивают. Инкубируют при комнатной температуре (+18-+20) в течение 20 минут и затем фотометрируют при длине волны 540 (520-560) нм. Концентрация гемоглобина в пробе крови вычисляют по формуле: С= ( Е/Ек) х Ск х 251, где: С – концентрация гемоглобина, г/л. Е – оптическая плотность пробы; Ек – оптическая плотность в калибровочном растворе гемиглобинцианида; Ск –концентрация гемиглобинцианид в калибровочном растворе, г/л. 251 –коэффициент разведения пробы крови Оптическая плотность калибровочного раствора гемиглобинцианида Ек=0,54 Ск = 0,602 г/л Норма гемоглобина у мужчин равна 130-160 г/л , у женщин – 120-145 г/л |