E coli молекулярные векторы генетической инженерии
 Скачать 439.76 Kb.
|
|
СОР ОС О В С КИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ БИОЛОГИЯ Щелкунов С.Н., БИОЛОГИЯ bbНИТЕВИДНЫЕ ФАГИ E. coli – МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ С. Н. ЩЕЛКУНОВ Новосибирский государственный университет PHAGES E. coli – MOLECULAR VEHICLES OF GENETIC ENGINEERING S . N . S H C H E L K U N OV The development of a genetic engineering sys- tem of molecular vehicles on the basis of the circular DNA of filamentous viruses (phages) of bacteria Escherichia coli is Рассмотрен вопрос о том, как была разработана генно-инженерная система молекулярных векторов на основе кольцевой ДНК нитевидных вирусов фагов бактерии coli. ВВЕДЕНИЕ В генетической инженерии в качестве клонирующих векторных молекул используют широкий спектр плаз- мидных и вирусных двухцепочечных ДНК [1]. Однако в ряде случаев, например при определении последовательности нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, направленном мутагенезе и некоторых других, необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. При этом приходится разделять цепи ДНК, что не всегда можно сделать достаточно просто. Поэтому клонирование ДНК в одноцепочечных векторах является привлекательным объединением водном эксперименте процедур изолирования целевой последовательности ДНК, ее размножения (амплификации) и разделения цепей исходно двухцепочечного фрагмента ДНК. НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ Нитевидные вирусы М, fd, f1 бактерии Escherichia кишечной палочки, называемые обычно бактериофагами или просто фагами, наиболее подходят для создания одноцепочечных векторных молекул ДНК. Частицы этих фагов представляют собой трубочку (1000 х 6 нм) из гидрофобного фагового белка pVIII, внутри которой содержится молекула кольцевой одноцепочечной ДНК. На одном из концов фаговой частицы молекула ДНК взаимодействует с несколькими молекулами фагового белка pIII, называемого белком-лоцманом [2]. Последовательность нуклеотидов фаговой ДНК расшифрована нуклеотидов для фага M13, 6408 для фага Нитевидные фаги адсорбируются на половых ворсинках клеток E. coli (белковых трубочках, предназначенных для переноса ДНК из клетки в клетку риса, и одно- цепочечная кольцевая ДНК фага в комплексе с белком- лоцманом проникает в цитоплазму клетки (рис. 1, б, где происходит достройка второй цепи фаговой ДНК. Образовавшаяся двухцепочечная кольцевая молекула ДНК (рис. 1, в, называемая репликативной формой (РФ), реплицируется, достигая 200–300 копий на клетку. Затем репликация этих молекул ДНК в основном ЩЕЛКУНОВ С . Н . НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ 3bБ ИО ЛОГИ Я осуществляется асимметрично и синтезируется большое количество одной из двух цепей (обозначается как (+)-цепь), которая покрывается димерами фагового белка pV (рис. 1, г) и взаимодействует с белком-лоцма- ном pIII (рис. 1, д. При выходе фаговой ДНК из клетки через плазматическую мембрану белок pV постепенно замещается на белок оболочки pVIII, находящийся на клеточной мембране (рисе. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно секретируются из клеток без лизиса (разрушения) последних. Длина ви- рионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Скорость роста клеток E. coli , зараженных нитевидным фагом, на 25–50% ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании на твердой агаризованной среде нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении данных фагов их геном в бактериальной клетке одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочеч- ной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. На одноцепочечной вирионной ДНК обычные генно-инженерные эксперименты невыполнимы. Однако их с успехом можно осуществить на репликативной форме генома нитевидных фагов. Все это обусловило использование данных фагов для создания клонирующих векторов. ФАГ МВ КАЧЕСТВЕ КЛОНИРУЮЩЕГО ВЕКТОРА Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в которой могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага. Реп- ликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих рестриктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров и Цитоплазматическая мембрана Белок pV а д б в г е ДНК Белок оболочки Белок Клеточная стенка Половая ворсинка Рис. 1. Схема цикла развития нитевидного фага [2]: а – е – этапы развития. Объяснения в тексте СОР ОС О В С КИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ БИОЛОГИЯ bуникальных участков расщепления определенными рестриктазами. Первый гибридный фаг M13 был описан Мессин- гом с соавторами в 1977 году. Репликативная форма ДНК фага M13 гидролизуется рестриктазой Bsu RI на фрагментов, имеющих тупые концы. Чтобы получить полный фаговый геном в линейной форме, РФ гидролизовали ограниченным количеством рестриктазы Bsu RI так, что каждая молекула ДНК в среднем расщеплялась лишь водном из участков действия Линейные молекулы размером в полный фаговый геном выделили электрофоретически и к ним добавили Hind II-фрагмент лактозного оперона E. coli , имеющий размер 789 пар нуклеотидов (пни содержащий часть гена lacI , промоторно-операторную область и начальную часть гена lacZ , кодирующую 145 концевых аминокислот β -галактозидазы (рис. 2). Полученные фрагменты сшили по тупым концам с помощью ДНК- лигазы фага T4 и провели трансфекцию клеток E. Для понимания принципа осуществленного затем отбора гибридных фагов рассмотрим строение лактозно- го оперона E. coli Лактозный оперон (оперон) E. coli состоит из трех генов, с которых транскрибируется единая поли- цистронная мРНК (рис. 3). Синтез мРНК оперона регулируется белком, называемым репрессором. Этот белок кодируется геном lacI . В активной форме репрессор связывается на ДНК с операторным участком (о) lac-оперона и блокирует транскрипцию мРНК с промотора. Блокированный таким образом оперон называют репрессированным. При инактивации репрессора (в результате мутации или связывания с определенными небольшими молекулами) он теряет способность образовывать комплекс с оператором. Наибольший интерес для молекулярных биологов в опероне представляет ген lacZ . Продукт этого гена β -галактозидаза ( β -Gal) – катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу и легко определяется по специфической ферментативной активности. Наиболее популярный способ фенотипического выявления активности β -Gal состоит в том, что в агари- зованную питательную среду, на которой выращивают колонии E. coli , добавляют 5-бром-4-хлор-3-индолил- β -D-галактозид (обозначаемый Xgal). Данное соединение само по себе бесцветно. Однако при его гидролизе β -галактозидазой образуется ярко-синий бром- хлориндиго. Поэтому колонии E. coli lacZ + в присутствии окрашиваются в синий цвета мутантные варианты формируют белые колонии. Рассматриваемый фермент обладает уникальными свойствами. В 1968 году была описана так называемая α -комплементация β -галактозидазы, которая относится к внутрицистронной (внутригенной) комплемента- ции и состоит в том, что в результате нековалентной ассоциации различно измененных мутантных форм или фрагментов одного итого же белка образуется функционально активный фермент. Полипептид β -Gal состоит из 1021 аминокислотного остатка. Ферментативной активностью обладает белок, состоящий из четырех таких субъединиц (тетрамер с суммарной молекулярной массой 460 кДа). При изучении различных мутантов по гену lacZ были выявлены неактивные формы β -галак- тозидазы, обозначенные M15 и M112 и имеющие соответственно делеции аминокислот с й пою (11–41 АК) и с й пою АК). Оказалось, что эти IR II “X” V VII VIII III VI I IV M13 HindII HindII α -Донор lac'I lacZ' PO Z' OP 'I M13 mp2 EcoRI 'I OP Z' IR IR II “X” V VII VIII III VI I IV M13 Неполный гидролиз BsuRI ДНК-лигаза фага Т4 Мута- генез Рис. 2. Схема создания гибридных фагов М IR – межгенная область фагового генома; римскими цифрами обозначены гены фага ЩЕЛКУНОВ С . Н . НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ 5bБ ИО ЛОГИ Я мутантные белки не образуют тетрамерной структуры, а являются димерами. Более того, было обнаружено, что если к препарату β -Gal M15 или M112 добавить пептид АК, то происходит комплементация – восстанавливается ферментативная активность. Такой фермент, подобно нативному, имеет тетрамерную структуру. Неактивные белки с делецией в концевой последовательности получили название акцепторы, а комплементирующие их пептиды или мутантные формы белка – доноры. В более поздних исследованиях было показано, что пептид 3-41 АК также является полностью активным донором по отношению к Таким образом, возвращаясь к экспериментам Мессинга с соавторами, подчеркнем, что гибридный фаг M13, содержащий встраиваемый фрагмент лактозного оперона, должен детерминировать в клетках синтез полноценного донора (1-145 АК) β -галактозидазы. Наиболее простой способ выявления такого синтеза состоит в использовании в качестве хозяина мутантного штамма E. coli , синтезирующего α -акцептор β -Gal. В этом случае in vivo будет происходить α -комплементация и фенотип Lac − исходных клеток изменится в инфицированных клетках на Lac + . Одним из наиболее простых методов тестирования такого изменения фенотипа является, как указывалось выше, цитохимическая реакция, происходящая в агаризован- ной среде, содержащей хромогенное соединение Газон реципиентных клеток E. coli , синтезирующих α -акцептор β -Gal (обычно используют мутант lacZ M15), на среде сбудет белого цвета, а окрашивание в синий цвет должно выявляться только в районах скопления клеток, инфицированных гибридным фагом (бляшках. При этом исходный фаг формирует бесцветные бляшки. Отобранный на среде с Xgal гибридный фаг, синтезирующий донор β -галактозидазы, обозначили (см. рис. 2). Однако этот фаг еще нельзя было использовать в качестве векторного, так как в нем отсутствовали единичные места гидролиза рестриктаза- ми в межгенной области. Поэтому была предпринята попытка образовать рестрикционное место, используя мутагены, специфично действующие на одноцепочеч- ную ДНК. Из известной к тому времени нуклеотидной последовательности начала структурного гена lacZ следовало, что если гуанин в положении 13 заменить на аденин, то образуется специфичная последовательность, узнаваемая рестриктазой Eco RI (рис. После мутагенеза ДНК вводили в клетки E. coli и индивидуальные фаговые клоны подвергали проверке на наличие участка гидролиза рестриктазой Eco RI на РФ фаговой ДНК. В результате такой работы выделили мутант фага M13mp1, имеющий участок узнавания рестриктазы Eco RI. Мутантный фаг обозначили (см. рис. 2). В полученном фаге в аминокислотной последовательности синтезируемого фрагмента β -галактозидазы в пятом положении произошла замена аспарагиновой кислоты на аспарагин. При этом α -комплементация β -Gal M15 не нарушилась, так как данная область донора для комплементации несуще- ственна. При встройке чужеродных фрагментов ДНК по Eco RI-месту M13mp2 в большинстве случаев прекращается синтез функционального донора. В результате такие гибридные фаги образуют при инфекции мутантных клеток E. coli на среде с Xgal бесцветные бляшки, в то время как исходный фаг M13mp2 формирует бляшки синего цвета. Как видим, полученный фаг уже является клонирующим вектором, позволяющим осуществлять прямой отбор гибридов. Для расширения возможностей клонирования различных фрагментов в векторном фаге M13mp2 в его ДНК по месту встроили синтетические двухце- почечные фрагменты ДНК (обычно называемые поли- линкерами), которые содержат разные комбинации уникальных участков гидролиза различных рестриктаз. lacI P O lacZ lacY lacA Репрессор Репрессия синтеза Репрессор Индукция синтеза Индуктор мРНК Рис. 3. Схема лактозного оперона E. coli . P – промотор оператор. Объяснения в тексте Исходный пептид (+) цепь после метилирования Комплементарная ( − ) цепь после ошибочной репликации (+) цепь (потомство мутантного фага) Экспрессируемый мутантный пептид- … ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-AAT-TCA-CT … …5' ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-GAT-TCA-CT … …5' H 2 N-Thr-Met-Ile-Thr-Asp-Ser- … …3' TAC-TGG-TAC-TAA-TGC-TTA-AGT-GA Рис. 4. Схема мутационного введения участка действия рестриктазы. Eco RI в ДНК фага M13mp1 СОР ОС О В С КИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ БИОЛОГИЯ bСозданные фаги получили названия M13mp7, M13mp8, M13mp9 и др. Используя данный набор векторных нитевидных фагов, можно решать большой спектр генно- инженерных задач. ДРУГИЕ НИТЕВИДНЫЕ ФАГИ ТОЖЕ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕКТОРОВ Кроме векторов на основе фага M13 получены векторы на основе фагов fd и f1. На рис. 5 приведены структуры нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага M13mp1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотиками поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. Расширить возможности использования одноцепо- чечных векторов удалось путем совмещения генетических элементов плазмид и нитевидных фагов в составе одной молекулы ДНК. Дотто с соавторами в 1981 году по Eco RI-участку плазмиды pBR322 встроили фрагмент реп- ликативной формы ДНК фага f1 размером 1,3 тыс. пн, включающий все элементы генома, необходимые для инициации репликации и морфогенеза фага, и показали, что при суперинфекции фагом f1 клеток E. coli , содержащих созданную плазмиду pD4, примерно половина секретируемых в культуральную среду вирионов несет одноцепочечную ДНК фага f1, а другая половина одноцепочечную ДНК гибридной плазмиды. В дальнейшем был получен большой набор таких плаз- мид, которые часто называют фагмидами (вследствие возможной двоякости их существования. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Из проведенного выше рассмотрения видно, что векторная система нитевидных фагов разработана достаточно хорошо. Это обусловливает все более активное применение в последние годы данных векторов для расшифровки нуклеотидной последовательности (сек- венирования) клонированных фрагментов ДНК, для направленного мутагенеза клонированных генов. Все чаще векторные производные нитевидных фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках. coli . На основе использования генно-инженерно реконструированных нитевидных фагов сформулировано и интенсивно развивается новое направление моле- кулярно-биологических исследований, получившее название фаговый дисплей. ЛИТЕРАТУРА 1. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия Учеб. пособие В 2 ч. Новосибирск: Изд-во Новосиб. унта, 1994–1997. 2. Лурия С, Дарнелл Дж, Балтимор Д, Кэмпбелл Э Общая вирусология. М Мир, 1981. 680 с. Рецензент статьи ЛИ. Корочкин * * Сергей Николаевич Щелкунов, доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета, завотделом молекулярной биологии геномов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии Вектор (Коль- цово Новосибирской обл, член-корреспондент РАЕН. Область научных интересов – структурно-функцио- нальная организация и эволюция вирусных геномов, противовирусные вакцины, генетическая инженерия. Автор трех монографий и двухтомного учебного пособия для вузов Генетическая инженерия r Ap r fd 103 HaeII PvuI PstI BamHI EcoRI BamHI HaeII HaeII PstI BamHI HaeII BamHI PvuI XhoI SmaI HindIII Km r fd 101 BamHI HaeII PvuI HaeII Ap r BamHI HaeII XhoI SmaI PvuI HindIII HaeII EcoRI HaeII BamHI fd Рис. 5. Рестрикционные карты репликативных форм ДНК векторных фагов fd. Обозначены фрагменты ДНК 1 – фага fd; 2, 3 – различных плазмид. Ap r , Km r , Cm r – гены устойчивости к антибиотикам ампициллину, канамицину и хлорамфениколу соответственно |