Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) - Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) - особый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности.
- Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы с размерами, превышающими максимальный диаметр пор, вообще не удерживаются и элюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими чем минимальный диаметр пор сорбента, свободно проникают в поры и элюируются из колонки последними. Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются на фракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. В результате вещества элюируются с различными временами удерживания
- Если говорить о белках, то большинство из них имеют компактную форму молекул, но некоторые из них имеют цилиндрическую форму и вследствие этого больший гидродинамический радиус в растворе и поэтому элюируются раньше, чем ожидается. Более того, различные подвижные фазы могут способствовать изменению формы молекул в растворе (гидродинамического радиуса или радиуса инерции), что приводит к изменению порядка элюирования
- Для наиболее успешного разделения, поддержания растворимости веществ и исключения нежелательных вторичных взаимодействий подбираются определенные условия хроматографии: размер пор, выбор колонки, скорости потока, температура, а также параметры подвижной фазы: ионная сила, рН, добавление органических модификаторов. Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярных масс веществ по графику зависимости объема удерживания веществ от логарифма их молекулярных масс, определения молекулярно-массового разделения полимеров методом сравнения со стандартными образцами и определения относительного компонентного состава смесей по отношению площади пика к сумме площадей пиков
Эксклюзионная хроматография широко используется для характеризации биотерапевтических молекул в процессе их разработки и производства.С помощью данного метода обеспечивается качественное разделение и исследование белков, которые содержат агрегаты, вспомогательные вещества, клеточный детрит (мертвое органическое вещество) и другие загрязнения, образующиеся при деградации белков.Гель-фильтрация также нашла применение как мягкий способ обессоливания растворов ферментов, белков, олигосахаридов. Примером использования эксклюзионной хроматографии являются клинические испытания биоаналога инсулина. Гель-фильтрация позволяет обнаружить примеси и агрегаты, наличие которых в лекарственных препаратах недопустимо - Основное назначение гель-хроматографии - разделение смесей высокомолекулярных соединений (а также высокомолекулярных и низкомолекулярных) и определение молекулярномассового рас-пределения полимеров. Как и ионообменная хроматография гель-хроматография может быть колоночной и плоскостной, проводиться как в «классическом» варианте, так и в высокоэффективном
Оборудования - Хроматографы ХЖ-1304 и ХЖ-1307 приспособлены для высокоскоростной эксклюзионной хроматографии, причем ХЖ-1304 имеет также градиентное устройство. Все эти приборы, за исключением ХЖ-1302, оборудованы двумя детекторами рефрактометрическими и УФ-спектрофотометрическими.
- Таким образом, гель фильтрация представляет собой метод разделения молекул в соответствии с их размером. В отличие от ионообменной и аффинной хроматографии молекулы образца не связываются с сорбентом, таким образом, состав буфера не влияет на разрешающую способность метода (расстояние между пиками). Следовательно, важным преимуществом ГФ является то, что условия среды могут быть изменены в соответствии с типом образца или требованиями для дальнейших этапов очистки или хранения. ГФ подходит для биомолекул, которые чувствительны к изменениям рН, концентрации ионов металлов и другим условиям среды. Разделение может быть выполнено в присутствии необходимых ионов, детергентов, при высокой или низкой ионной силе, при 37 градусах цельсия или на холоду в соответствии с требованиями эксперимента.
|
Скачать 290.74 Kb.