Коллоквиум. микра 1 колок. Это невидимые простым глазом представители всех царств (бактерии, грибы, простейшие, синезеленые водоросли, вирусы)
 Скачать 57.06 Kb.
|
|
Билет 1. Микроорганизмы – это невидимые простым глазом представители всех царств (бактерии, грибы, простейшие, сине-зеленые водоросли, вирусы). Эукариоты имеют дифференцированное ядро, отграниченное от цитоплазмы ядерной мембраной, аппарат митоза и ядрышко. К эукариотам относятся простейшие, дрожжи и нитчатые грибы. Прокариоты – это организмы, у которых нет оформленного ядра, а есть эквивалент ядра – нуклеоид, который представлен одной или несколькими хромосомами, расположенными в цитоплазме и не отграниченными от нее никакой мембраной. Прокариоты не имеют дифференцированного аппарата митоза, у них нет ядрышка. Они имеют рибосомы 70S, клеточную стенку, содержащую пептидогликан. Размеры прокариотов колеблются от 1 до 20 мкм, у них нет митохондрий и хлоропластов. Среди прокариотов есть аэробные и анаэробные организмы. К вирусам относят организмы, у которых геном представлен ДНК или РНК, отсутствуют белоксинтезирующие системы, вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Систематика микроорганизмов занимается подробным описанием видов организмов, выяснением степени родства между ними, объединением их по уровню родства в классификационные единицы – таксоны. Таксономия – это наука о принципах и методах распределения организмов в иерархическом плане. Классификация – составная часть систематики, она распределяет микроорганизмы по различным таксонам. Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение, сходный генотип, среду обитания и свойства, а также способность вызывать сходные процессы в организме человека или внешней среде. Последующие более крупные таксономические единицы: род, семейство, порядок, класс, отдел, царство. 1. Нумерический подход. Он основан на оценке степени сходства и различия организмов по максимально возможному количеству фенотипических свойств и проявлений. 2. Генетический подход.Он основан на сходстве в строении ДНК геномов изучаемых бактерий. 3. Типирование по рибосомальной РНК (риботипирование). Особенности микроорганизмов определили набор признаков и свойств, которые используются в систематике и классификации: 1. Морфологические – величина, форма, взаимное расположение. 2. Тинкториальные – способность окрашиваться различными красителями при сложных методах окрашивания. 3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах. 4. Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии разделяются на ползающие и плавающие, у которых подвижность связана с наличием жгутиков. 5. Физиологические свойства – способы питания, дыхания. 6. Биохимические свойства – способность расщеплять белки, углеводы, жиры до конечных продуктов обмена. 7. Чувствительность к специфическим бактериофагам. 8. Антигенные свойства (выявляют в иммунологических реакциях). 9. Липидный, белковый и углеводный состав. Белковые спектры определяют с помощью метода двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, где разделяют смеси рибосомных, мембранных и внутриклеточных белков, получая белковые спектры соответствующей фракции определенного вида бактерий. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии. 10. Генетические свойства. Их изучают, используя методы геносистематики. Билет 2 Кокки – шаровидные клетки: Микрококки, Диплококки, Стрептококки, тетракокки, Сарцины, Стафилококки Палочковидные: монобактерии – палочки располагаются одиночно и беспорядочно, сюда относится большинство палочковидных бактерий; – диплобактерии располагаются попарно (род Pseudomonas); – стрептобактерии или стрептобациллы – бактерии располагаются цепочкой. Извитые формы – спиралевидные бактерии, по количеству и характеру завитков, а также по диаметру клеток подразделяют на три группы: – вибрионы – спириллы – спирохеты Нитевидные и ветвящиеся формы Билет 3 Метод фазового контраста Метод фазового контрастаи его разновидность — т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Метод темного поля и его разновидности Метод тёмного поля в проходящем свете ( Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой. Метод исследования в свете люминесценции Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность. Билет 4,5,6,9,10 Бактерии I и II отделов – это простейшие одноклеточные организмы, не имеют хлорофилла. Содержат нуклеиновую кислоту, белки, полисахариды, липиды, минеральные вещества, воду, микроэлементы. У них всегда присутствуют оболочка, цитоплазма и нуклеоид. Не у всех бактерий имеются капсула, жгутики, фибриллы, пили, споры, включения. Все эти структуры выявлены различными методами. Их величину определяют ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией, микроскопией с использованием микрометра. Она колеблется от 0,1 нм до 10-20 нм (1000 нм=1 мкм; 1000 мкм=1 мм). Оболочка бактерий состоит из трех слоев: слизистого (поверхностного), собственно клеточной стенки и ЦПМ – цитоплазматической мембраны. Слизистый слой располагается поверх клеточной стенки, состоит из высокополимерных мукополисахаридов, которые не имеют с клеточной стенкой постоянной и прочной связи. Клеточная стенка бактерий и грибов располагается между цитоплазматической мембраной и капсулой (если она имеется) или ионизированным слоем внешней среды Главным и специфичным для клеточной стенки компонентом является муреин или пептидогликан. Он имеется только у эубактерий (кроме микоплазм). Пептидогликан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек – боковых и поперечных. Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную структуру, пластичный слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она толще, чем у грамотрицательных бактерий – 20-60 нм. У грамположительных бактерий клеточная стенка на 60-90% состоит из пептидогликана и тесно связанных с ним тейхоевых кислот. Клеточная стенка выполняет следующие функции: определяет и сохраняет постоянную форму микробной клетки; является осмотическим барьером, защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды; имеет своеобразное строение в виде «сита», через ее поры в клетку проникают питательные вещества, а из клетки выделяются продукты метаболизма, токсины, ферменты; участвует в регуляции роста и деления клеток; в клеточной стенке находятся гидролитические ферменты. Они обеспечивают рост клеточной стенки, а при гибели - аутолиз её; защищает клетку от неблагоприятных воздействий (температура, химические вещества); в ней локализуются основные антигенные детерминанты для взаимодействия со специфическими антителами и бактериофагами; имеет сложный химический состав, который позволяет дифференцировать клетки на грамположительные и грамотрицательные; Цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана имеет три слоя – двойной фосфолипидный и глобулярный белковый. Она ограничивает цитоплазму, поддерживает постоянство осмотического давления, необходимого для нормального метаболизма клетки, контролирует водный и солевой обмен, обеспечивает питание бактерий за счет ферментов-пермеаз, расположенных в ЦПМ. За счет окислительно-восстановительных ферментов ЦПМ принимает участие в процессах дыхания. ЦПМ участвует в делении клетки, биосинтезе компонентов клеточной стенки и капсулы, в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид. Цитоплазма – это коллоидная масса, заключенная в оболочку. Химический состав её сложный (белки, полисахариды, липиды, РНК, микроэлементы, минеральные вещества). Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядерной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата. В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделению дочерних хромосом при репликации. Бактерии – гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправленном состоянии ее длина 1 мм. Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках – несколько, в старых – 1, у кокков – 1, у палочковидных – много. Жгутики – органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3-5х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфичностью (см. Н-антиген). По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи – имеют 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихи – без жгутиков. Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) – это органы прикрепления. Наиболее изучены 2 вида пилей – половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина. Фибриллы (периплазматические жгутики) – органы передвижения у спирохет, они состоят из отдельных переплетающихся нитей и располагаются между клеточной стенкой и ЦПМ. Капсула – структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхности клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных мицелл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), полипептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микроскопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который непрочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микроба. У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes). У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringens капсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором вирулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых металлов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью. Билет 7 Споры – покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри цитоплазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспечивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микробы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэробные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в связанное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры. Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из которых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов – проспора (предспора) – покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клетки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикальный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой оболочкой – экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого наступает аутолиз вегетативной клетки. При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация метаболических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса. Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста. Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор. Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция. Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою биомассу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов. Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специальный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препарат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зерна. Билет 11 |