Фотометрия совокупность оптических методов и средств измерения
 Скачать 5.8 Mb.
|
|
ФОТОМЕТРИЯ - совокупность оптических методов и средств измерения фотометрических величин светового потока Спектрофотометрия – определение зависимости фотометрических величин от длины излучения Спектроскопия – (эмиссионный спектральный анализ) – определение излучательной способности вещества в зависимости от длины волны излучения В КЛД применяются методы количественного анализа, основанные на переведении определяемых компонентов в поглощающие свет соединения с последующим определением их количества путем измерения поглощения света Свойства растворенного вещества- коэффициент пропускания (Т) - коэффициент отражения (R) - коэффициент поглощения (А) (Для одного и того же вещества – Т + R + А = 1) Фотометры – приборы, регистрирующие реакции приемника оптического излучения на поток излучения Отражательные фотометры – приборы регистрирующие отражение оптического излучения Схема измерения рассеянного цветаНефелометрия – изучение способности рассеивать свет А – нефелометр, регистрирующий малоугловое рассеяние; Б - нефелометр, регистрирующий рассеяние под углом 90° ТурбидиметрияИзучение способности пропускать излучение Оптическое излучение- электромагнитные колебания определенного диапазона частот, распространяющихся в пространстве со скоростью с (для вакуума –λ=с/ν) Спектр – частотный состав электромагнитного излучения Источники электромагнитных волнДиапазоны оптического излученияВолновые характеристики светаСветовые волны являются плоскопоперечными, распространяются в однородной среде перпендикулярно направлению электрического и электромагнитного полей. Поляризованный свет - свет, в котором направления колебаний упорядочены каким-то образом Если колебания светового потока происходят только в одной в одной проходящей через луч плоскости – плоскополяризованный свет КогерентностьКогерентность - согласованное протекание во времени и пространстве колебательных или волновых процессов, проявляющееся при их сложении Колебания когерентные, если разность их фаз остается постоянной во времени, сложение колебаний определяет амплитуду суммарного колебания Сложение колебаний двух световых волн (пунктир) с амплитудами А1 и А2 при различных фазах. Результирующее колебание – сплошная линия Квантовые характеристики светаФотон – элементарная частица света Энергия Е=hv Масса m= Е c2 Импульс Р= hv c С – скорость света, v= С λ -частота электромагнитной волны, h –постоянная Планка Отсутствует масса покоя, торможение (поглощение) фотона связано с превращением кванта света в другой вид энергии Квантовые характеристики света Фотон – элементарная частица света Квантовые характеристики света Взаимодействие света с веществомЗакон отражения света – падающий и отраженный лучи, а также перпендикуляр к границе раздела сред, восстановленный в точке падения луча, лежат в одной плоскости. Закон преломления света – падающий и преломленные лучи, а также перпендикуляр к границе раздела сред, восстановленный в точке падения луча, лежат в одной плоскости. Отношение синуса угла падения α к синусу угла преломления β – величина постоянная для данных сред. Отражение света от стенок кюветы с неокрашенной прозрачной жидкостьюСуммарное отражение от стенок кювет составляет около 9,2% светового потока S – точечный источник света При переходе света из оптически более плотной среды в менее плотную возможно полное отражение (исчезновение преломленного луча). Граница стекло-водух α=42º,вода-воздух α=48,7º Полное внутреннее отражение света на границе вода-воздух При переходе света из оптически более плотной среды в менее плотную возможно полное отражение (исчезновение преломленного луча). Граница стекло-водух α=42º,вода-воздух α=48,7º Рефракция светаМера электронной поляризуемости вещества, характеризующая кго физико-химическое состояние Рефрактометрически определяют содержание общего белка в сыворотке или высушенных препаратах крови Прохождение белого света в рефрактометре АббеНаблюдение светового потока, прошедшего через слой раствора вещества, помещенного между двумя призмами. Поворотом зеркала освещают призму белым светом. затем поворотом призмы добиваются появления темного поля в окуляре, при котором луч света полностью отражается от поверхности раздела между призмой и исследуемым веществом 1 – зеркало, 2 – призма, 3 – слой исследуемого вещества, 4 – шкала отсчета, 5 – окуляр, 6 – поле окуляра Дисперсия светаРаспространение света в среде связано с поляризуемостью молекул. Под действием поля электроны атомов или молекул вещества совершают вынужденные колебания. При совпадении частоты колебания поля приходящей волны и собственной частоты колебания электронов возникает резонанс поглощение света. Дисперсия света – зависимость фазовой скорости распространения световой волны от длины волны. Дисперсия вещества – величина определяющая скорость изменения коэффициента преломления с изменением длины волны в веществе Дисперсия света в прозрачной призмеДля прозрачных веществ коэффициент преломления монотонно возрастает с увеличением длины волны (синие лучи преломляются сильнее красных). Разложение света в диспергирующих призмах используется в монохроматорах фотометров для выделения определенной длины волны Интерференция светаНаблюдается при определенных условиях при наложении нескольких световых пучков. Интенсивность света в области перекрытия пучков – чередующие светлые и темные полосы. При интерференции белого света интерференционные полосы окрашены в различные цвета спектра. Интерференция световых волн заключается в сложении колебаний частот к различными фазами: Интерференция в тонких пленкахБелый свет, падая на пленку, частично проникает в пленку, отразившись от нижнего слоя, выходит из нее. Лучи отраженного света когерентны, т. к. происходят от одного входного луча, но имеют разность фаз, определяемую толщиной пленки, углом падения и длиной волны света Ход лучей в тонком слое полупрозрачного вещества Интерференционный светофильтрИмеет слои из нескольких тончайших непоглощающих слоев из диэлектрических материалов – окислов Al2O3, SiO3, TiO2, фторидов MgF2, CaF2, LiF2, сульфидов ZnS, CdS и др. Наносятся на стекло вакуумным напылением. Внешние слои из металлов – служат полупрозрачными зеркалами. Белый свет при прохождении через систему с многочисленными границами многократно переотражается. Часть лучей ослабляется назначительно, а часть – в 103-106раз А. ИС-интерференционная система, ОС-отрезающая система.1-стеклянные плоскопаралельные пластинки, 2-полупрозрачные металлические слои, 3-диэлектрические слои Б. Преобразование белого света интеференционным светофильтром с рабочей длиной волны 600 нм Полоса пропускания светофильтраПолоса пропускания тем меньше, чем больше слоев имеет светофильтр. Отрезающая система подавляет все частоты, кроме рабочей Технически возможно изготовление светофильтров с полосой пропускания до 1 нм. В клинической биохимии используются светофильтры с полосой пропускания 10 нм Светофильтры в фотометрах используются в качестве монохроматоров Дифракция светаОтклонение света от прямолинейного распространения, когда свет огибает контур непрозрачных тел. Является следствием проявления волновых свойств света На щель падает световая волна, фокусирую линзой свет, прошедший через щель, можно наблюдать чередование максимумов и минимумов освещенности Дифракция пучка света в узкой щели. В области геометрической тени светлые полосы. Изображение размыто Дифракция света на решеткеДифракционная решетка состоит из прозрачных участков , разделенных непрозрачными промежутками. На решетку направляется параллельный пучок света. В каждой точке Р на экране соберутся лучи, которые до линзы были параллельны и отклонились на решетке под определенным углом (дифракционный максимум) Распределение интенсивности при дифракции монохроматического света на решетках с различным количеством щелейI 0 – интенсивность колебаний при дифракции света на одной щели Решетка являетсясоставной частью монохроматоров Поляризация светаВыделение из пучка естественного света лучей, поляризованных в определенной плоскости Левая пластинка (турмалин) выделяет электромагнитные колебания с вертикально направленным вектором Е. Интенсивность света, прошедшего через правую пластинку (анализатор), зависит от угла поворота анализатора ПоляриметрияОптически активные вещества – способны изменять (вращать) плоскость поляризации. Поляриметрический метод основан на измерении угла вращения плоскости поляризации луча света, прошедшего через оптически активную среду, помещенную между поляризатором и анализатором Оптическая активность вещества обусловлена Особенностью кристаллической решетки вещества (кристаллы, хлорид натрия и др.) Особенностью строения молекулы вещества (растворы органических веществ – глюкозы, винной кислоты и др.) Схема простейшего поляриметра1 – поляризатор, 2 – пластинка бикварца, 3 – кювета с раствором, 4 - анализатор КолориметрияОптические свойства окрашенных растворов. Свет отражается от стенок, поглощается раствором. I = I0-Iотр-Iр-Iа Коэффициент пропускания Оптическая плотность Закон Бугера-ЛамбертаИнтенсивность окраски выражают величиной оптической плотности Однородные слои одного и того же вещества поглощают ту же долю падающей на них световой энергии Оптическая плотность вещества прямо пропорциональна толщине поглощающего слоя Степень поглощения вещества зависит от числа частиц в единице объема (концентрации) D = k * l * C k – показатель поглощения L – толщина слоя C – концентрация вещества Зависимость оптической плотности от толщины поглощающего вещества Колориметрические методы измеренийВизуальные методы Метод цветовых шкал (определение Hb по цвету капиллярной крови) Метод разбавления (определение Hb по Сали) Метод уравнивания интенсивности окраски (определение Hb на компараторе цвета –сравнение с цветными стандартами) Метод диафрагм или оптического клина (сравнение с окраской стандарта) Фотоэлектрические методыОпределение мощности светового потока, прошедшего через исследуемый раствор с помощью фотодетекторов Молярный показатель поглощенияВ кювете с фиксированной длиной оптического пути (1 см) оптическая плотность и концентрация связаны через молекулярный показатель поглощения ελ. Он специфичен для каждого вещества, определяется структурой вещества, характеризует способность молекул вещества поглощать свет с длиной волны λ и не зависит от концентрации вещества Единица измерения ελ л/(моль*см)-1 (если С в моль/л, длина оптического пути – 1 см) Измерение в многокомпонентных растворахПринцип аддитивности – поглощение отдельного вещества не зависит от других веществ, обладающих собственным поглощением Спектр поглощения Кумасси бриллиантового синего без белка и в соединении с белком Измерение в максимуме спектральной полосы поглощенияСпектральные характеристики хромогеновСпектры поглощения4-нитрофенолфосфата (1) и 2-нитрофенольного аниона (2), образующегося при расщеплении субстрата Спектры поглощения НАД+ (1) и НАДН (2) Измерение на оптимальной длины волныЕсли в многокомпонентной системе несколько компонентов имеют максимум поглощения в одной области, то измерение проводят на длине волны, на которой существенно различаются оптическая плотность рабочего раствора и исследуемого вещества Приборы для фотометрического анализаФотометрОптический прибор, позволяющий измерять световой поток на фиксированных длинах волн Основные компоненты одноканального фотометра СпектрофотометрОптический прибор, который разлагает световой поток на непрерывный спектр и позволяет измерять его на любой длине волны в пределах оптического диапазона. Используется диспергирующая призма или дифракционная решетка Основные компоненты спектрофотометра Источники светаТепловые источники – лампы накаливания (вольфрамовая спираль, 2500-2700º, диапазон 340-1000 нм). При испарении материала нити колба темнеет, а нить становится тоньше Время работы – 100 часов Спектры фольфрамовой лампы накаливания Источники светаГалогеновые лампы – содержат газ-наполнитель с добавкой галогенов (устраняется потемнение колбы) Уменьшен размер колбы Время работы до 4000 часов Источники светаГазоразрядные лампы Водородные и дейтериевые лампы (кварцевая трубка, содержащая анод катод, заполненная водородом или дейтерием). Дают непрерывный спектр в УФ-области (185-360 нм) Дуговые ртутные лампы (люминесцентно-тепловые). Имеют самонагревающиеся фольфрамовые электроды, покрытые оксидной пастой. В лампе – строго определенное количество ртути и спектрально чистый аргон. Основная часть излучения – дуговой разряд паров ртути, имеющее линейчатый спектр Срок службы – 1500 – 3000 часов Источники светаСветоизлучающие диоды – полупроводниковые приборы, преобразующие электрическую энергию в энергию оптического излучения на основе инжекционной электролюминисценции. Инжекционные фотодиоды и их нормализованные спектры Источники светаЛазеры – оптические квантовые генераторы Узко направленный пучок Когерентность (луч характеризуется высокой монохроматичностью и минимальным рассеиванием в однородной среде) Некогерентный световой пучок Когерентный световой пучок Спектральная фильтрация- стеклянный абсорбционный фильтр (пропускает свет относительно широкого диапазона – более 50 нм) - комбинация широкополосных и отрезающих стеклянных фильтров (несколько широкополосых и отрезающих фильтров можно получить фильтр с более узкой полосой) - узкополосые интерференционные фильтры – точность установки длины волны – 2 нм, спектральная полоса 10 нм Монохроматорсистема выделения излучательной энергии необходимой длины волны и подавления других волн - входная щель коллиматор диспергирующее устройство фокусирующий объектив выходная щель МонохроматорВходная и выходная щель – получение достаточно резкого и четкого изображения спектральной линии оптического излучения Коллиматор – получение параллельных пучков белого света, направленных на диспергирующую систему (объектив или вогнутое зеркало, в фокусе которого) Диспергирующее устройство (призма, дифракционная или голографическая решетка) ПолихроматорСпектр воспринимается матрицей фотоприемников. Рабочая спектральная полоса определяется размером фотоприемника. Оптическая плотность может измеряться одновременно каждым фотоприемником матрицы в соотвествующей этому приемнику спектральной полосе КюветыСтекляннные кюветы – не пропускают УФ Для λ<300 нм –кюветы из кварца Пластиковые кюветы из полистирола макротипа 10х10х45 (V= 1,0 мл), полумикрокюветы 10х4х45 (V= 0,5 мл) и полумикрокюветы 10х2х45. Спектральные характеристики близки к кварцевому стеклу Групповые кюветы (для фотометров с вертикальным фотометрированием) Приемники оптического излученияЭлектровакуумные фотоэлементы Фотоэлектронные умножители (кроме фотокатода и анода содержит фокусирующую электронно-оптическую систему, диафрагму и дополнительные электроды Фотодиоды – полупроводниковые приборы основанные на внутреннем фотоэффекте Устройства считыванияСтрелочные гальванические элементы (измерение тока напрямую или индикатор нуля при выравнивании сигнала по бланку) Цифровые индикаторы со светодиодными элементами (обеспечивают изображение чисел, соответствующее оптической плотности или концентрации) Жидкокристаллические индикаторы Регистрирующие устройстваИспользуют малогабаритные принтеры со струйной печатью или термопечатью. Некоторые спектрофотометры оборудованы графопостроителями для отражения фотометрических данных Спасибо за внимание Оптическая схема нефелометра1 – лампа, 2,11 – светофильтры; 3 – стеклянная пластинка, разделяющая свет на 2 пучка; 4 – кювета с исследуемым раствором; 5 – ловушка света; 7, 8, 9 – линзы; 8 – уравнительные диафрагмы; 10 – ромбические призмы; 12 - окуляр Схема пламенного фотометра1 – цилиндры с топливом и воздухом; 2 – клапаны регуляции давления и устройства для измерения расхода газов; распылительная камера; 6 – устройство для осушения распылительной камеры, 7 – фокусирующая линза; входная щель монохроматора; 9 – призма, разделяющая свет по длине волны; 10 – выходая щель монохроматора; 11 - фотодетектор |