Микра. Инфекция и иммунитет_методичка. инфекция. Врожденный иммунитет (семинар)
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
Титр комплемента - это наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу комплемента рассчитывают исходя из его титра. Рабочая доза должна быть выше титра комплемента на 25%. Таблица . Реакция титрования комплемента Ингредиенты пробирки 1 2 3 4 5 6 7 Контроль комплем. 8 Контроль гем. сист 9 Комплемент в разведении 1:10, мл 0,20,250,30,35 0,4 0,45 0,5 0,5 -- Изотонический раствор, мл 1,31,251,21,15 1,1 1,05 1,0 1,5 1,5 Гемолитическая система, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 1,0 Инкубация при 37 o C в течение 30 минут Результаты: (гемолиз/отсутствие гемолиза): ВЫВОД: титр комплемента ______ мл; рабочая доза комплемента ________ мл. РЕАКЦИЯ СВЫЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fс-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом АГ+АТ. Если же комплекс антиген антитело не образуется, то комплемент остается свободным. Образовавшийся в реакции иммунный комплекс является мелкодисперсным и не определяется визуально. Поэтому для выявления связывания комплемента в реакции применяется индикаторная гемолитическая система: эритроциты барана и гемолитическая сыворотка с антителами к ним. Если антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поэтому при добавлении в опытную пробирку гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса АГ+АТ (эритроциты барана и антитела к ним), происходит активация комплемента с последующим образованием мембраноатакующего комплекса (МАК) и гемолизом эритроцитов барана, что визуально проявляется феноменом «лаковой крови». Цели постановки РСК: 1.для экспресс диагностики выявления микробных антигенов (обнаружения бактерий) в материале от больного (например при диагностике гонореи исследуется моча, секрет предстательной железы, гнойные выделения из шейки матки); 2.для выявления антител в сыворотке крови больного Компоненты РСК с целью определения АТ: 1. исследуемая сыворотка 2. антиген 3. комплемент (сыворотка морской свинки) 4. гемолитическая система состоящая из : а) гемолитической сыворотки (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) б) эритроциты барана Рисунок . Схема реакции связывания комплемента (РСК) РСК проводят в две фазы: 1 фаза - специфическая: инкубация смеси антигена, испытуемой сыворотки и комплемента в термостате течении 30 минут. 2 фаза- индикаторная: в опытную пробирку и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после инкубации в термостате в течении 30 мин. ценить Последовательность действий Контроль сыворотки- сыворотка+комплемент+ электролит+ гемолитическая система Контроль антигена – антиген+комплемент+ электролит+ гемолитическая система Учет результата: 1 Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. Учет результатов Индикаторная фаза В опытную и все контрольные пробирки добавить одинаковые количества гемолитической системы. Инкубация в термостате 30 минут Специфическая фаза В опытной пробирке смешивают равные количества известного антигена, сыворотки пациента и комплемента. Приготовление контролей сыворотки и антигена Инкубация в термостате 30 минут. 2. Положительный результат –отсутствие гемолиза ( жидкость в пробирке полностью бесцветная, а эритроциты оседают на дно). 3. Результат считают отрицательным при наличии гемолиза, который проявляется изменением цвета раствора в пробирке из темно-красного в ярко красную прозрачную жидкость («лаковая кровь») за счет разрушения эритроцитов. Титр РСК- максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором наблюдается положительный результат в виде отсутствия гемолиза. Таблица . Реакция связывания комплемента с исследуемой сывороткой Ингредиенты Опыт 1 Контроль сыворотки 2 Контроль антигена 3 Исследуемая сыворотка в разведении 1:25, мл 0,5 0,5 -- Антиген (диагностикум), мл 0,5 -- 0,5 Комплемент в рабочей дозе, мл 0,5 0,5 0,5 Изотонический раствор, мл -- 0,5 0,5 Инкубация при 37 o C в течение 45-60 минут Гемолитическая система, мл 1,0 1,0 1,0 Инкубация при 37 o C в течение 45-60 минут Результаты: (гемолиз/отсутствие гемолиза): Сыворотка больного Сыворотка здорового ВЫВОДЫ: РСК положительная/отрицательная с сывороткой здорового, т.к. ________________________________________________________________. РСК положительная/отрицательная с сывороткой больного, т.к. ________________________________________________________________. СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ: ЗАДАЧА №1 Лаборанту требуется поставить реакцию связывания комплементы (РСК) с целью определения АТ к возбудителю. В лаборатории имеются следующие ингредиенты: 3% взвесь эритроцитов, эритроцитарные диагностикумы, бактериальный диагностикум, растворимый диагностикум из бактериального гаптена, антиглобулиновая сыворотка, комплемент, гемолитическая система. 1. Какова цель постановки РСК 2.Подберите необходимые ингредиенты для постановки реакции 3. Как должен выглядеть положительный результат реакции ЗАДАЧА №2 Объясните, какой феномен лежит в основе РСК. Какова роль комплемента в защите организма человека? ЗАДАЧА № 3. В лабораторию поступила кровь больного с подозрением на гонорею. Для подтверждения диагноза необходимо поставить РСК с целью определения АТ к возбудителю. Какие ингредиенты необходимо подготовить для её постановки? По какому признаку оценивается положительный или отрицательный результат реакции? ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ: 1. Комплемент: 1. В норме находится в неактивном состоянии 2. Компонент клеточной стенки бактерий 3. Активируется комплексом «антиген-антитело» 4. Обеспечивает противовирусную защиту 2. Компоненты реакции иммунного гемолиза: 1. Эритроциты 2. Комплемент 3. Гемолитическая сыворотка 4. Диагностикумы 3.Перечислите компоненты РСК с целью определения антител: 1. Антигенный диагностикум 2. Комплемент 3. Гемолитическая система 4. Исследуемая сыворотка 4. Пути активации комплемента: 1. классический 2. интерфероновый 3.лектиновый 4. альтернативный 5. Результатом активации комплемента является: 1. лизис бактериальных клеток 2. агглютинация бактериальных клеток 3. опсонизация бактериальных клеток 4. образование хемоаттрактантов С3а и С5а ЗАНЯТИЕ ТЕМА: «РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА С «МЕЧЕННЫМИ» РЕАГЕНТАМИ: РИФ (прямой и непрямой варианты), ИФА» В современной лабораторной диагностике все большее распространение получают серологические реакции с использованием меченых компонентов: антигенов или антител. В качестве меток могут использоваться различные химические вещества, позволяющие визуализировать результат реакции, а именно образование комплекса антиген- антитело. К таким веществам относятся флюорохромы- вещества, светящиеся в ультрафиолетовом свете; радиоизотопы, ферменты. Сами метки не влияют на способность компонентов реакции образовывать иммунные комплексы. В зависимости от используемой метки выделяют следующие реакции: 1. Иммуноферментый анализ (ИФА)- в качестве метки используется фермент 2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)- в качестве метки используется флюорохром 3. Радиоиммунный анализ (РИА)- в качестве метки используется радиоизотоп (радиоактивное вещество). ИММУНОФЕРМЕНТНВЙ АНАЛИЗ (ИФА) Иммуноферментный анализ (ИФА)- предназначен для выявления антигенов или антител с помощью соответствующих им антител/антигенов, конъюгированных с меткой - ферментом (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и пр). Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Различают несколько десятков модификаций ИФА: 1. ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метод определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами; 2. EIA (enzyme immunoassay) - метод на основе фермент-иммуноопределения; 3. EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - способ, основанный на связи с ферментами. ELISA и EIA - это методы гетерогенного или твердофазного анализа (тИФА), EMIT является гомогенным ИФА. Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Цели постановки ИФА: 1. Обнаружение специфических антител в биологических материалах (сыворотка крови, слюна и пр) 2. Обнаружение искомых антигенов в биоматериале Компоненты ИФА с целью определения антигена: 1. Антитело 2. Антиген 3. Конъюгат – антитело, меченное ферментом 4. Субстрат – вещество, на которое специфически направлено действие фермента. В результате взаимодействия фермента с субстратом возникает продукт реакции. 5. Хромоген – это вещество, обычно бесцветное (лейкоформа), но способное давать окрашенное соединение (хромоформу) в результате взаимодействия с продуктом, возникающим при ферментативной реакции. Виды твердофазного ИФА Последовательность действий при прямом методе ИФА («сэндвич» - метод) Прямой метод Непрямой метод Конкурентный метод "Сэндвич"- метод Ингибирующий метод Учет результата реакции Добавить субстрат и хромоген Инкубация при комнатной температуре в течении 20 минут. Добавить меченные ферментом антитела той же специфичности- конъюгат Инкубация при комнатнй температуре в течении 20 минут. Отмывка буферным раствором несвязавшихся компонентов В лунки планшета с адсорбированными специфическими антителами добавить исследуемый антиген Инкубация при комнатной температуре в течении 10 минут. Отмывка несвязавшегося антигена буферным раствором Положительные контрольный образец Отрицательный контрольный образец Контроль конъюгата Контроль субстрат-хромогенного реактива Учет результата: 1. Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. 2. Положительный результат – появление окраски или изменение оптической плотности в лунке (субстрат расщепляется ферментом, продукты реакции окисляют хромоген и появляется окраска или изменяется оптическая плотность среды в лунке)) 3. Результат считают отрицательным если цвет раствора в лунках планшета не изменяется. Данный метод называется « сэндвич»- метод, так как при постановке реакции антиген оказывается между иммобилизированными и мечеными антителами. Рисунок . Схема проведения иммуноферментного анализа (ИФА, «метод сэндвича») Таблица . Схема постановки ИФА Ингредиенты Опыт «Положительный контроль» «Отриц. контроль» A 1 A 2 B 1 B 2 C 1 C 2 D 1 D 2 E 1 E 2 F 1 F 2 G 1 G 2 H 1 H 2 1. Буфер A (мл) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Инкубация при комнатной температуре 10 мин. 2. Сыворотка больного (мл) 0,1 -- -- -- -- -- -- -- 3. Стандартный антиген 100 мкг/мл (мл) -- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 вылить -- 4. Отрицательный контроль (мл) -- -- -- -- -- -- -- 0,1 Инкубация при 37 o C в течение 20 мин. 5. Конъюгат (мл) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Инкубация при 37 o C в течение 20 мин. 6. Субстрат (мл) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Инкубация при комнатной температуре 20 мин. 7. 50%H 2 SO 4 (мл) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Результаты: ВЫВОДЫ: ИФА ________________(положительная/отрицательная). Концентрация HBs антигена _______ мкг/мл РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ) РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)- это реакция обнаружения специфических антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток). Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Цели постановки: Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой. При прямом методе РИФ специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся ярко-зеленым светом по периферии при люминесцентной микроскопии. Схема прямого метода РИФ Компоненты прямой РИФ: 1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.); 2) меченая флюорохромом специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ к искомому антигену; 3) изотонический раствор хлорида натрия. Последовательность действий: Учет результатов реакции: Положительный результат- обнаружение флюоресценции в виде ярко-зеленого свечения при люминесцентной микроскопии в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ. Отрицательный результат- черное поле зрения при люминесцентной микроскопии. Оценка результата при помощи люминисцентной микроскопии Инкубация в течении 15-30 минут Отмывка и высушивание препарата Обработка препарата (мазка) из исследуемого материала специфическй люминисцирующей сывороткой Непрямой метод РИФ состоит из двух этапов: -на первом этапе препарат из исследуемого материала обрабатывают нелюминесцирующей иммунной сывороткой к искомому антигену -на втором этапе препарат обрабатывают люминесцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей флюоресцирующие антиглобулиновые антитела. Схема непрямого метода РИФ Компоненты непрямой РИФ: 1) исследуемый материал; 2) специфическая иммунная сыворотка без флюорохрома; 3) антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулина), меченная флюорохромом; 4) изотонический раствор хлорида натрия. Последовательность действий: Учет результатов реакции: Положительный результат- обнаружение флюоресценции в виде ярко-зеленого свечения при люминесцентной микроскопии в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ. Отрицательный результат- черное поле зрения при люминесцентной микроскопии. Примеры: Оценка результата при помощи люминисцентной микроскопии Инкубация в течении 15-30 минут. Отмывка буфером и высушивание Обработка препарата люминесцирующей антиглобулиновой сывороткой. Инкубация в течении 15-30 минут. Отмывка буфером несвязавшихся антител. Обработка препарата (мазка) из исследуемого материала специфическй иммунной сывороткой без флюорохрома с последующим образованием невидимого комплекса АГ-АТ СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ: ЗАДАЧА №1 При постановки ИФА используют конъюгат. Объясните значение этого компонента. Предложите состав этого компонента для реакции ИФА, которая ставится с целью определить антитела в сыворотке больного. ЗАДАЧА №2. Лаборанту требуется поставить реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РИФ). В лаборатории имеются следующие ингредиенты: исследуемый материал; специфическая иммунная сыворотка без флюорохрома; конъюгат антиглобулиновой сыворотки с ферментом, антиглобулиновая сыворотка, меченная флюорохромом, флюорохром, комплемент. 1. Какова цель постановки непрямой реакции иммунофлюоресценции 2. Подберите необходимые ингредиенты для постановки реакции ЗАДАЧА №3 В диагностических целях при ряде инфекций проводится постановка ИФА 1. Каковы цели постановки этой реакции 2. Объясните механизм этой реакции и перечислите необходимые компоненты для ее постановки 3. Каким образом производится учет результатов реакции ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ: 1. РИФ используется для: 1. Микробиологической экспресс-диагностики 2. Определения специфических антител 3. Идентификации микробов 4. Титрования комплемента 2. Иммуноферментный анализ (ИФА) применяется для: 1. Определение неизвестных антител по известному антигену 2. Определение количества эритроцитов 3. Определение неизвестного антигена по известным антителам 4. Определение титра комплемента 3. Антитела в РИФ метят 1. Радиоактивным изотопом 2. Супероксидным анионом 3. Флюорохромом 4. Ферментом 4. Достоинства РИФ: 1. Высокая чувствительность 2. Возможность использования для экспресс-диагностики 3. Быстрота получения результатов 4. Специфичность 5. В каких реакциях используют меченные АТ: 1. ИФА 2. РИФ 3. РСК 4. РИА |