Микра. Инфекция и иммунитет_методичка. инфекция. Врожденный иммунитет (семинар)
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
отрицательным, если в опытной капле имеется равномерное помутнение как и в контроле антигена. Оценить результат реакции В каплю с физ р-ром и в одну из капель с сывороткой внести антиген ( ч.к. бактерий) и хорошо перемешать Нанести на стекло одну каплю изотонического раствора и две капли сыворотки на расстоянии друг от друга Взять предметное стекло и обезжирить его Рисунок . Реакция агглютинации на стекле 1. С адсорбированными сыворотками Опыт ч.к. бактерий+ брюшнотифозная сыв. Контроль сыворотки (капля сыворотки) Контроль антигена (ч.к.+физ.р-р) ВЫВОД : Развернутая реакция агглютинации Последовательность действий Контроль сыворотки- исходное разведение сыворотки Контроль антигена- -диагностикум или взвесь живых бактерий Учет результата: 1. Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. Оценить результат реакции Инкубация при 37 0 С в течении 2 часов, далее 24 часа при комнатной температуре Во все пробирки внести по 3 капли антигена ( диагностикума ) В опытных пробирках произвести 2-кратные серийные разведения сыворотки физиологическим раствором в соотношении от 1:50 до 1:800 в объеме 2 мл Подготовить 7 одинаковых пробирок: 5 опытных и 2 контрольные 2. Учет результата проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка в виде хлопьев (агглютинат, состоящий из комплексов АТ+АГ) или мутности. 3. О-антитела дают мелкозернистый осадок; Н-антитела- крупнозернистый ( крупнохлопчатый) 4. Результат считают отрицательным, если в опытных пробирках раствор остается прозрачным как и в контролях. Диагностический титр - определяется по последней пробирке в которой еще видна реакция агглютинации. При серологической диагностике инфекционных заболеваний важно не только выявить наличие антител к определенному возбудителю в сыворотке пациента, но и определить их количество, то есть определить такой титр антител (диагностический титр), по которому можно судить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Диагностический титр реакции определен для каждого возбудителя и указан в справочнике по инфекционным болезням. Метод парных сывороток - определение нарастания титра антител в парных сыворотках пациента. Для «метода парных сывороток» сыворотку пациента отбирают в начале заболевания и спустя 7-10 дней от его начала. Серологическую реакцию ставят одновременно с двумя отобранными в разное время сыворотками. Возрастание титра антител в 4 раза и более подтверждает диагноз текущего инфекционного заболевания. Таблица 15. Развернутая реакция агглютинации с сывороткой больного Ингредиенты пробирки 1 2 3 4 5 Контроль сыворотки Контроль антигена Изотонический раствор, мл 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -- 1,0 Сыворотка больного в исходном разведении 1:25, мл 1,0 → → → → вылить 1,0 -- Разведения сыворотки 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:25 -- О-диагностикум (в каплях) 3 3 3 3 3 -- 3 Н-диагностикум (в каплях) 3 3 3 3 3 -- 3 Термостат при 37 о С в течение 2 ч., затем при комнатной температуре 24 ч. Результат: О-агглютинация Н-агглютинация ВЫВОДЫ: реакция агглютинации положительная/отрицательная. Титр антител к О-антигену - ________. Титр антител к Н-антигену - ________. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РПГА) Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации - это реакция агглютинации, в которой либо антигены, либо антитела адсорбированы на эритроцитах, которые пассивно склеиваются при образовании иммунного комплекса АГ+АТ с образованием характерного осадка. В качестве инертных корпускулярных носителей кроме эритроцитов могут использовать: частицы латекса, угля и т.д. Если на поверхности носителя, например, эритроцита, адсорбированы антитела определенной специфичности, то получают антительный эртитроцитарный диагностикум (используется для серотипирования) Если на поверхности носителя, например, эритроцита, адсорбированы антигены, то получают антигенный эртитроцитарный диагностикум (используется для серодиагностики). Цели постановки РПГА: 1.Для идентификации возбудителя по его антигенной структуре 2. Для индикации и идентификации бактериальных продуктов-токсинов в исследуемом патологическом материале. Рисунок . Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) Последовательность действий: Контроль сыворотки- исходное разведение сыворотки+ физ раствор Контроль антигена- эритроцитарный диагностикум+ физ раствор Учет результата: 1. Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. 2. Положительный результат - в лунке характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с фестончатыми краями в виде «зонтика» 3. Результат считают отрицательным, если в опытных лунках эритроциты оседают на дно и имеют вид « пуговки» с ровными краями. Титр РНГА - максимальное разведение сыворотки, дающее положительную реакцию («зонтик») Оценить результат реакции Инкубация при 37 0 С в течении 30-60 минут Во все лунки внести по 0.25 мл капли антигена (эритроцитарный диагностикум ) В опытных лунках произвести 2-кратные серийные разведения сыворотки физиологическим раствором в соотношении от 1:10 до 1:160 Подготовить полистероловый планшет с лунками Таблица 16. Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) Ингредиенты пробирки 1 2 3 4 5 Контроль антигена Контроль сыворотки Изотонический раствор, мл 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Сыворотка больного в исходном разведении 1:25, мл 0,25 → → → → вылить -- -- Разведения сыворотки 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 -- 1:10 Эритроцитарный диагностикум, мл 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 -- При комнатной температуре в течение 30-60 минут Результат: ВЫВОД: реакция пассивной гемагглютинации положительная до титра __________. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП) Реакция преципитации (РП)- это реакция осаждения специфических мелкодисперстных (молекулярных) антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Цели постановки РП: Для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины), то есть для серотипирования. Используется для диагностики ряда инфекций (туляремия, сибирская язва и пр); в санитарно-гигиенических исследованиях для установления фальсификации продуктов; в судебной медицине- для определения видовой принадлежности крови и других биологических жидкостей. Компоненты реакции преципитации: 1) молекулярный антиген (прецитиноген) чаще белково-полисахаридной природы; 2) антитело (преципитин); 3) электролит (изотонический раствор). Преципитирующие сыворотки получают путем гипериммунизации кроликов вводя им специфические преципитины-диагностикумы. Титр преципитирующей сыворотки- это наибольшее разведение антигена, с которым эта сыворотка дает положительную реакцию. Разновидности реакции преципитации Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках, куда вносится иммунная сыворотка и на нее медленно наслаивается раствор антигена. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе раздела этих двух растворов образуется кольцо преципитата молочного цвета. Реакция кольцеприципитации Реакция преципитации в геле Метод простой иммунодиффузии по Манчини Иммуноэлектрофорез Метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлони Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипячённые и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция носит название реакции термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильных антигенов возбудителей сибирской язвы и чумы. Последовательность действий: Оценить результат реакции Медленно вернуть пробирку в вертиальное положение и наблюдать реакцию Наклонив пробирку почти горизонтально, осторожно по стенке пробирки наслоить антиген (преципитиноген) В узкую преципитационную пробирку внести 0.2-0.3 мл преципитирующей сыворотки Положительный контроль: Контроль сыворотки- преципитирующая сыворотка Контроль антигена- стандартный антиген Отрицательный контроль: - с нормальной (неиммунной сывороткой) и исследуемым антигеном. Учет результата: 1. Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. 2. Положительный результат – на границе раздела раствора антигена и антитела образуется белое кольцо-преципитат, состоящий из комплексов АГ+АТ. 3. Результат считают отрицательным, если растворы в пробирке остаются прозрачными. Таблица . Реакция кольцепреципитации для определения неизвестного белка Ингредиенты Неизвестный белок Преципитирующая сыворотка против белка человека Преципитирующая сыворотка против белка курицы ВЫВОД: Неизвестный белок принадлежит ________________. Таблица . Реакция кольцепреципитации для определения неизвестного гаптена Ингредиенты Неизвестный белок Преципитирующая сыворотка против B.cereus Преципитирующая сыворотка против E.coli ВЫВОД: Неизвестный гаптен принадлежит ________________. РЕАКЦИЯ КУМБСА Реакция Кумбса- реакция для выявления неполных антител при помощи антиглобулиновой сыворотки. Цель постановки: выявление неполных антител для определения совместимости при гемотрансфузиях, при резус- конфликте, в диагностике ряда аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний (например, выявление неполных антител к возбудителю бруцеллеза) Неполные (моновалентные) антитела, связываясь с эпитопами антигена, не образуют структуру решетки и реакция между антигенами и антителами не выявляется ни агглютинацией, ни преципитацией, ни другими тестами. Для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют дополнительную тест систему (например, антиглобулиновая сыворотка при обнаружении антирезусных антител). СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ: ЗАДАЧА №1 В лабораторию от больного брюшным тифом поступила кровь. Необходимо поставить развернутую реакцию агглютинации. Какие ингредиенты будут использованы для её постановки? Какой показатель реакции будет использован в качестве диагностики? ЗАДАЧА №2 Лаборанту требуется поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) с целью определения экзотоксинов возбудителя. В лаборатории имеются следующие ингредиенты: 3% взвесь эритроцитов, гемолитическая система, эритроцитарный антительный диагностикум, бактериальный диагностикум, эритроцитарный антигенный диагностикум, растворимый диагностикум из бактериального гаптена, антиглобулиновая сыворотка, комплемент. 1. Какова цель постановки РПГА 2.Подберите необходимые ингредиенты для постановки реакции 3. Как должен выглядеть положительный результат реакции ЗАДАЧА №3 В лабораторию поступил материал – образцы шкуры с кожзавода с целью выявления зараженности сырья возбудителем сибирской язвы. Какую серологическую реакцию следует применить для обнаружения термостабильного антигена возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале? Можно ли использовать этот тест для обнаружения возбудителей при других заболеваниях, если да – то при каких ТЕСТОВЫЙ КОНТРОЛЬ: 1. Реакция агглютинации 1. Определение неизвестных антител по известным антигенам 2. Определение неизвестных антигенов по известным антителам 3. Антиген в растворимом состоянии 4. Антиген в корпускулярном состоянии 2. Иммунодиагностика: 1. Применяется для определения антител к возбудителю в сыворотке больного 2. Применяется для идентификации микробов 3. Применяется для определения патогенности 4. Применяется для определения степени вирулентности 3. Химические вещества, являющиеся полноценными антигенами: 1. Белок 2. Минеральные соли 3. Полисахарид 4. Липид 4. Перечислите компоненты реакции преципитации: 1. Эритроциты 2. Молекулярный антиген 3. Корпускулярный антиген 4. Специфическая иммунная сыворотка 5. Антиген в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации 1. Содержит радиоактивные изотопы 2. Адсорбирован на эритроцитах 3. Содержит флюорохромом 4. Конъюгирован с ферментом ЗАНЯТИЕ Тема: «РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА С УЧАСТИЕМ КОМПЛЕМЕНТА: РЕАКЦИЯ ИММУНОГО ГЕМОЛИЗА, РСК» Система комплемента — это многокомпонентная полиферментная самособирающаяся система сывороточных белков, которые в норме находятся в неактивном состоянии. При появлении во внутренней среде микробных продуктов запускается процесс, который называют активацией комплемента. Активация протекает по типу каскадной реакции, когда каждый предшествующий компонент системы активирует последующий. В процессе самосборки системы образуются активные продукты распада белков, которые выполняют три важнейшие функции: вызывают перфорацию мембран и лизис клеток, обеспечивают опсонизацию микроорганизмов для их дальнейшего фагоцитоза и инициируют развитие сосудистых реакций воспаления. В систему комплемента входит 9 основных белков (обозначаемых как С1, С2—С9), а также субкомпоненты — продукты расщепления этих белков (Clg, С3в, С3а и т.д.), ингибиторы. Ключевым событием для системы комплемента является его активация. Пути активации системы комплемента Классический путь Альтернативный путь Лектиновый путь Биологические эффекты продуктов активации комплемента: •вне зависимости от пути активация комплемента завершается образованием мембраноатакующего комплекса (С5, 6, 7, 8, 9) и лизисом клеток (бактерий, эритроцитов и других клеток); •образующиеся С3а- и С5а-компоненты являются анафилотоксинами, они связываются с рецепторами кровяных и тканевых базофилов, индуцируют их дегрануляцию — выброс гистамина, серотонина и других вазоактивных медиаторов (медиаторов воспалительного ответа). Кроме этого С3а и С5а является хемоаттрактантами для фагоцитов, он привлекает эти клетки в очаг воспаления; •С3в, С4в являются опсонинами, повышают адгезию иммунных комплексов с мембранами макрофагов, нейтрофилов, эритроцитов и тем самым усиливают фагоцитоз. Иммунный лизис - это разрушение клеток, несущих антигены, связанные антителами, в присутствии комплемента. Из реакций лизиса чаще сего применяются реакция гемолиза и бактериолиза. РЕАКЦИЯ ГЕМОЛИЗА (РГ) Реакция гемолиза (РГ)- лизис эритроцитов в присутствие специфических антител и комплемента Цели постановки: Реакция гемолиза имеет прикладное значение. По феномену гемолиза учитывают результаты в реакции титрования комплемента и РСК. Компоненты реакции иммунного лизиса: 1) антиген (корпускулярный)- 3% взвесь эритроцитов барана; 2) антитело (гемолитическая сыворотка) - антитела к эритироцитам барана, которые получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана; 3) комплемент- коммерческий препарат, получают из сыворотки крови морских свинок путем лиофилизации Последовательность действий: Контроль 2- эритроциты барана + гемолитическая сыворотка+ физ р-р Контроль 3- эритроциты собаки + комплемент+ физ р-р Контроль 4- гемолитическая сыворотка+комплемент+ эритроциты собаки Контроль 5- эритроциты барана+ физ р-р Учет результата: 1. Возможен ТОЛЬКО при безупречных контролях сыворотки и антигена. 2. Положительный результат – изменение цвета раствора в пробирке из темно- красного в ярко красную прозрачную жидкость («лаковая кровь») за счет разрушения эритроцитов. 3. Результат считают отрицательным, если гемолиза в пробирке нет. Оценить результат реакции Инкубация в течении 30 мин при 37 0 С В опытную пробирку внести по 0.5 мл гемолитической сыворотки, эритроциты барана и комплемент Таблица . Реакция иммунного гемолиза Ингредиенты Опыт 1 Контроль 2 Контроль 3 Контроль 4 Контроль 5 Гемолитическая сыворотка кролика, мл 0,5 0,5 -- 0,5 -- Эритроциты барана, мл 0,5 0,5 0,5 -- 0,5 Комплемент в разведении 1:10, мл 0,5 -- 0,5 0,5 -- Эритроциты собаки, мл -- -- -- 0,5 -- Физиологический раствор, мл -- 0,5 0,5 -- 1,0 Общий объем, мл 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Инкубация при 37 o C в течение 45-60 минут Результат: (гемолиз/отсутствие гемолиза): ВЫВОД: Реакция иммунного гемолиза положительная/отрицательная, т.к. _______________________________________________________________________ Титрование комплемента сыворотки крови Для определения титра и рабочей дозы производят титрование комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза Последовательность действий Оценить результат реакции. Определить титр комплемента и рабочую дозу комплемента Инкубация в течении 30 мин при 37 0 С В пробирки с комплементом в разведении 1:10 в объемах (0,2;0,25;0,3;0,35;0,4;0,45;0,5мл) внести по 1.0 мл гемолитической системы (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка) и физ раствор |