|
|
Серологические реакции. Наименование реакции Реакция агглютинации
Наименование реакции
|
Реакция агглютинации
|
РНГА
|
Реакция преципитации
|
Реакция нейтрализации токсина анатоксином
|
Наименование и характеристика ингредиентов реакции:
1. антиген
2. антитело
3. дополнительный (неспецифический) компонент
|
1. АГ (агглютиноген) – микробы, другие клетки или частицы, носители антигена
2. АТ агглютинины класса IgM и IgG
3. Электролит
|
1. Растворимые АГ, токсины, гаптены
2. Эритроцитарный диагностикум - эритроциты (0-1 группы человека или барана) после обработки танином или формальдегидом
3. Электролит
|
1. Растворимые АГ(преципитиногены)
2. Специфические АТ сыворотки
3. Электролит
|
1. Белковые токсины бактерий
2. Антитоксины
|
Механизм реакции
|
В основе реакции лежит механизм образования «решетки»: в 1-ой фазе реакции поливалентные антигены и двухвалентные антитела образуют комплексы по типу решетки; во 2-ой фазе в присутствии электролита снижается заряд комплексов {Аг-Ат}, уменьшается растворимость и образуются видимые аггломераты (хлопья), выпадающие в осадок.
|
Комплексы АГ-АТ связываются между собой по типу «решетки». В присутствии электролита, вследствие снижения заряда и уменьшения растворимости, происходит агглютинация комплексов, образуются хлопья, позволяющие визуально учесть результат реакции.
|
Полидетерминантные АГ, представляющие собой прозрачный коллоидный раствор, и двухвалентные АТ (преципитирующие АТ принадлежат к классу IgG) образуют комплексы по типу решетки, в присутствии электролита, снижается заряд и уменьшается растворимость, преципитат выпадает в осадок.
|
Взаимодействии между экзотоксином (антигеном) и специфической антитоксической сывороткой (антитеаом — антитоксином), в результате чего образуется комплекс «антиген + антитело», и экзотоксин теряет свои токсические свойства.
|
Методы постановки
|
Реакция агглютинации на предметном стекле.
На предметное стекло наносят каплю диагностической сыворотки (разведена физиологическим раствором 1:10-1:20) и каплю физиологического раствора. Испытуемую культуру вносят сначала в контрольную каплю физиологического раствора, а затем в каплю диагностической сыворотки.
Развернутая реакция агглютинации в пробирках.
В штативе устанавливают 7 пробирок, первые 5 -опытные, 6-я и 7-я - контрольные. В опытных пробирках готовят серийные 2-кратные разведения испытуемой сыворотки в объеме 1,0 мл. В каждую опытную пробирку вносят по 3 капли диагностикума.
Контроли: контроль антигена, контроль сыворотки
Штатив с пробирками помещают на 2 часа в термостат при 37°С, Окончательный учет проводят на следующий день, после выдерживания пробирок при комнатной температуре.
|
Реакцию ставят на 96-луночных полистероловых планшетках. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56°С в течение 30 минут для уничтожения комплемента, готовят двукратные разведения (от 1:20 до 1:12000 и более) и разливают в лунки по 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума.
Контроли РНГА - сенсибилизированные эритроциты (диагности-кум) с физиологическим раствором; несенсибилизированные эритроциты с физиологическим раствором ; несенсибилизированные эритроциты с исследуемой сывороткой .
После 2 часов инкубации в термостате при 37°С или при комнатной температуре учитывают реакцию и определяют титр исследуемой сыворотки.
|
Реакция кольцепреципитации
В узкие пробирки (диаметром не более 0,5 см, иначе результат «расплывается») наливают 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 затем наслаивают 0,1 -0,2 мл исследуемого преципитиногена (если необходимо определить титр преципитиногена, то его берут в разных разведениях). Учет реакции проводят через 1-5 минут.
При положительной реакции на границе появляется непрозрачный преципитат в виде мутного кольца.
Реакция в геле
Расплавленный и немного остуженный 3% агар смешивают в соотношении 1:1 со специфической иммунной сывороткой. Полученную смесь наливают тонким слоем на обезжиренную стеклянную пластину. В застывшем геле пробойником вырезают лунки , в которые вносят исследуемый антиген. Пластины инкубируют в течение 24-48 часов при комнатной температуре.
|
Реакция нейтрализации in vivo. Исследуемый материал, в котором предполагают присутствие экзотоксина (определяемый антиген) смешивают со специфической антитоксической сывороткой (известные антитела), выдерживают смесь в термостате и затем вводят лабораторным животным (чаще используют мышей или морских свинок). Если произошла реакция нейтрализации , то животные остаются живыми.
Реакция in vitro.
В пять пробирок наливают по 2,0 мл токсина и возрастающие количества испытуемой антитоксической сыворотки . После инкубации при 45°С в течение 30 мин отмечают пробирку, где раньше всего наступила флоккуляция и имеется соответствие количества токсина количеству международных единиц сыворотки. В пробирках справа находятся смеси ингредиентов с преобладанием антитоксина, а в пробирках слева -смеси в с превышением антигена
|
Внешнее проявление реакции
|
Образование видимых глазу аггломератов – хлопьев.
|
«Зонтик» или «пуговка»
|
Образование кольца или дуги преципитации.
|
Флокуляция
|
Титр реакции
|
Титром сыворотки считается наибольшее (последнее) разведение сыворотки, в котором еще наблюдается четкая реакция агглютинации.
|
За титр РНГА принимают максимальное разведение сыворотки, дающее положительную реакцию в виде зонтика.
|
Титром реакции кольцепреципитации называется то наибольшее разведение преципитиногена, в котором еще образуется кольцо преципитата.
|
Титром антитоксической сыворотки считается количество ME в 1 мп сыворотки.
|
Цели постановки
|
Применяют в серодиагностике инфекционных заболеваний, при которых формируются антибактериальный иммунитет гуморального типа,
|
РНГА применяется для серодиагностики многих инфекционных заболеваний а также в диагностике неинфекционной патологии.
|
Для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов-диагностикумов.
|
Для выявления в исследуемом материале экзотоксина с помощью известной стандартной диагностической антитоксической сыворотки.
|
Наименование реакции
|
Бактериолиз
|
Имунный гемолиз
|
РСК
|
ИФА
|
МИФ
|
Наименование и характеристика ингредиентов реакции:
1. антиген
2. антитело
3. дополнительный (неспецифический) компонент
|
1.Корпускулярный АГ от живых бактерий
2.АТ – бактериолизины
3. Система комплемента
|
1.Корпускулярный АГ эритроцитов барана
2. АТ - гемолизины
3. Система комплемента
|
1. корпускулярный или растворимый АГ
Эритроциты барана
2.Комплементовсязывающие АТ
АТ-гемолизины
3. Система комплемента
|
1. АГ, меченые ферментами
2. АТ меченые ферментами
3. Субстрат и хромоген
|
1. м/о, АГ, отпечаток или срез с зараженной ткани
2. Спец. АТ, конъюгированные с флюорохромными кр.
3. Флюорохромные красители
|
Механизм реакции
|
Растворение бактерий в присутствии специфических АТ-бактериолизинов и комплемента. Многие виды бактерий не способны к лизису поэтому р-я применяется редко
|
Растворение эритроцитов в присутствии специфических АТ-гемолизинов и комплемента
|
Сложная серологическая реакция в которой участвуют 2 системы АГ-АТ, основная, индикаторная, а также комплемент
|
Используют 2 метода – прямой и непрямой
|
|
Методы постановки
|
Реакция бактериолиза in vitro.Ингредиент: живые бактерии, специфические к ним антитела (иммунная сыворотка), комплемент.
В опытную пробирку вносят взвесь живых бактерий, специфическую иммунную сыворотку и комплемент, в контрольную пробирку-те же бактерии, нормальную сыворотку (без специфических антител) и комплемент. После инкубации в течение 2 часов при 37°С из каждой пробирки делают высевы по 0,1 мл на чашки Петри с мясо-пептонным агаром. Опыт учитывают после суточной инкубации. На чашке с высевом из опытной пробирки колоний должно быть значительно меньше, чем в контроле (или они отсутствуют).
|
|
Определив титр и рабочую дозу участвующих в опыте ингредиентов, ставят основной опыт РСК (таблица 11). После внесения впробирку всех ингредиентов проводят первую фазу инкубации при температуре 37°С в течение 30 минут (или на холоде при 0-4°С в течение 18-20 часов, что повышает чувствительность реакции).
Вторую фазу ставят, добавляя в пробирки с первой системой сенсибилизированную гемолитическую систему (эритроциты барана и гемолитическую сыворотку), пробирки встряхивают и инкубируют при 37°С 20-30 минут.
Положительная реакция проявляется в виде задержки гемолиза.
|
Прямой метод ИФА для обнаружения антигена
В плоскодонных лунках полистероловых пластин сорбируют специфические антитела к определяемому антигену. В эти же лунки вносят исследуемый антиген. При инкубации на твердой фазе образуется комплекс {Ат-Аг}. После инкубации лунки несколько раз промывают буферным раствором . Затем в лунки вносят меченные ферментом антитела, называемые конъюгатом, против искомого антигена. Полистероловые пластины вновь инкубируют и затем тщательно промывают лунки. Образуется комплекс {AT-Ar-AT фермент}. Далее в лунки вносят смесь субстрата с хромогеном.
Непрямой метод ИФА для выявления антител в исследуемой сыворотке В лунках планшета сорбируют известный (специфический) анти- ' ген и добавляют испытуемую сыворотку больного. Далее добавляют конъюгат - меченные фер-ментом пероксидазой антитела против глобулинов человека, которые присоединяются к антителам испытуемой сыворотки Образовавшийся комплекс {Аг-Ат-Атфермент} выявляется после инкубации / с субстратом - пероксидом водорода и хромогеном
|
Прямой МИФ. Готовят препарат, который, возможно, содержит исследуемые антигены Препарат фиксируют жидким фиксатором, обрабатывают специфической люминесцирующеи антимикробной сывороткой 15-30 минут во влажной камере. Тщательно отмывают препарат и высушивают. Готовый микропрепарат рассматривают в люминесцентном микроскопе. Светящиеся ярко-зеленые изображения микроорганизмов свидетельствуют об образовании иммунных комплексов, что позволяет их идентифицировать
Непрямой МИФ. Микропрепарат, приготовленный и фиксированный как в прямом методе, сначала обрабатывают обычной специфической, не меченой диагностической сывороткой, полученной путем иммунизации кролика. После инкубации мазок отмывают буферным раствором от не связавшихся антител, окрашивают люминесцирующеи антиглобулиновой сывороткой против глобулинов кролика, инкубируют во влажной камере и снова промывают. При люминесцентной микроскопии будут видны светящиеся изображения антигенов
|
Внешнее проявление реакции
|
Сокращение количества колоний
|
Жидкость в пробирке становится ярко-розового цвета и прозрачная «лаковая кровь»
|
Жидкость прозрачная, выпадает осадок.
|
Окрашивание
|
Свечение в УФ-лучах
|
Титр реакции
|
Максимальное разведение специфической иммунной сыворотки при котором наблюдается лизис данного вида м/о в присутствии комплемента
|
|
Содержимое пробирки с наименьшим количеством комплемента, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
|
|
|
Цели постановки
|
Определение активности комплемента или гемолитической сыворотки
|
В РСК в качестве второй индикаторной системы
|
Серодиагностика инфекционных заболеваний
|
Выявление искомых АГ и АТ в минимальной концентрации
|
Выявление АТ в исследуемых сыворотках
| |
|
|
Скачать 67.5 Kb.