масс-спектрометрия в исследовании белков. Использование, подходы применения массспектрометрии в анализе белков

• Название: Использование, подходы применения массспектрометрии в анализе белков
• Анкор: масс-спектрометрия в исследовании белков
• Дата: 22.12.2022
• Размер: 1.86 Mb.
• Имя файла: Ms.pptx
• Тип: Документы; #858542

Использование, подходы применения масс-спектрометрии в анализе белков

Захарова НК

Группа ЦХМмд-01-22

Использование масс-спектрометрии в анализе белков

• уточнение первичной структуры
• определение пост-трансляционных модификаций
• идентификация белка

Классификация методов масс-спектрометрии

• Способ ионизации пробы (тип ионизатора)

1

• Способ анализа отношения масса/заряд (m/z)

(тип масс-анализатора)

2

характеристики отражены в названии конкретного

метода масс-спектрометрии

(напр., MALDI-TOF, где MALDI – тип ионизатора, TOF – тип детекции m/z)

3

Электрораспыление (ESI)

Преимущества:

• можно анализировать нелетучие

(длинные) полипептиды (500 АК)

• мягкий метод – фрагментации пептидов не происходит
• идеально сочетается с ВЭЖХ

Недостаток:

• пептиды должны быть растворимы в полярном растворителе

5

Матричная лазерная десорбция (MALDI)

Преимущества:

• можно анализировать нелетучие (длинные) полипептиды (длиннее, чем в ESI, 2000 АК)
• мягкий метод – фрагментации пептидов не происходит
• обеспечивается высокая чувствительность (фемтомоли, 10-15)

Недостаток:

• нужно подбирать вещество матрицы

Трехквадруполь

(QQQ)

Время-пролётное разделение

(TOF, Time Of Flight)

Orbitrap

Ионная ловушка

Методы разделения ионов (типы масс-анализаторов)

Тандемный масс-спектрометр (MS/MS)

Для детального анализа спектра пептидной смеси используют 2 последовательно соединённых через камеру соударений масс-спектрометра:

В первом проводится ионизация без фрагментации и разделение ионов (обычно ESI) в камере соударения проводится фрагментация полученных ранее ионов (столкновение с атомами инертного газа)

Во втором МС набор фрагментов ионов (дочерних) разделяется и детектируется

Родительский ион

Диссоциация, индуцированная столкновением, CID, collision induced dissociation

Дочерние ионы

Масс-спектрометрический протеомный анализ

Анализ препаратов белков состоит из:

1. Выделение и очистка смеси белков из объекта.

2. Разделение смеси на отдельные белки

(SDS-PAGE или 2D-PAGE).

3. Ферментативный протеолиз белка (трипсин) – получение триптических фрагментов.

4. Разделение смеси пептидов (ВЭЖХ).

5. Определение масс-спектра набора пептидов.

6. Анализ данных (сборка белковой молекулы с помощью протеомной базы данных).

Стратегии масс-спектрометрической характеристики белков протеома:

В bottom-up (снизу-вверх) протеомике неизвестный белок специфически расщепляется химически или ферментативно на пептиды, массы которых определяются с помощью масс-спектрометрии.

В top-down (сверху-вниз) протеомике с помощью масс-спектрометрии анализируются целые белки

Выводы: масс-спектрометрия – современный и весьма информативный метод для:

• уточнение первичной структуры
• определение пост-трансляционных модификаций
• идентификация белка