Бииохимия ответы на вопросы. Изоэлектрическая точка. Почему она различна для разных белков
 Скачать 15.84 Kb.
|
|
Изоэлектрическая точка. Почему она различна для разных белков? Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Амфотерные молекулы (цвиттер-ионы) содержат как положительные, так и отрицательные заряды, наличием которых определяется pH раствора. Заряд различных функциональных групп таких молекул может меняться в результате связывания или, наоборот, потери протонов H+. Величина изоэлектрической точки такой амфотерной молекулы определяется величинами констант диссоциации кислотной и осно́вной фракций: При изоэлектрической точке молекула белка электронейтральна и не передвигается в электрическом поле. В таком состоянии молекулы белка легко выпадают в осадок, чем и пользуются для разделения белковых веществ при их совместном присутствии.Большинство белков имеют изоэлектри-чеекую точку при рН от 4,0 до 8,0. Изоэлектрическая точка фермента желудочного сока пепсина находится в резко кислой среде при рН 1,0, а химотрипсина при рН 8,1. Белковые вещества в водной среде проявляют свойства амфо-терности, т. е. они ведут себя и как кислоты, имея карбоксильные группы, и как основания благодаря наличию аминных групп. Однако если раствор белка подкислять, то его кислотная диссоциация будет подавляться, белок заряжается положительно, образуется катион белка. Если добавлять щелочь, то щелочная диссоциация белка будет подавляться, белок заряжается отрицательно, появится анион белка. Следовательно, поведение белков в электрическом поле будет зависеть от аминокислотного состава их, что и используют для разделения белков на фракции при электрофорезе. Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (- ). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле. Белковые вещества в водной среде проявляют свойства амфотерности, т.е. они ведут себя и как кислоты, имея карбоксильные группы, и как основания, благодаря наличию аминных групп. Но если раствор белка подкислять, то его кислотная диссоциация будет подавляться, и белок будет заряжаться положительно - образуется катион белка. Если добавлять щёлочь, то щёлочная диссоциация белка будет подавляться, белок будет заряжаться отрицательно, появится анион белка. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой - значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Изоэлектрическая точка большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH3). рН плазмы крови около 7,36 - это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд. При диссоциации алкалоидов их ионы приобретают положительный заряд. Белки, имеющие отрицательный заряд при рН выше изоэлектрической точки, с катионами алкалоидов образуют соединения или комплексы. В живом организме имеются необходимые условия для взаимодействия белковых веществ с алкалоидами. Значение изоэлектрической точки зависит от аминокислотного состава и специфично для каждого белка, например, для казеина рНИЭТ = 4,7, для яичного альбумина – 4,8, яичного глобулина – 6,6, желатина – 4,9, зеина (кукурузного белка) – 6,2. Чем дальше будет отстоять значение рН среды от рНИЭТ, тем большим суммарным зарядом будут обладать молекулы белка и с большей скоростью двигаться в электрическом поле. Это свойство положено в основу электрофоретического метода, используемого для идентификации и фракционирования белков, а также при исследовании физико-химических свойств белков. Изоэлектрическая точка белковых веществ зависит от их природы. Так, изоэлектрической точке сывороточного альбумина соответствует рН = 4,8, р-глобулина - 5,2, у-глобулина - 6,4, фибриногена - 5,4, пепсина- 1,0. При рН, находящемся выше изоэлектрической точки, белок имеет отрицательный заряд. По мере возрастания рН среды отрицательный заряд белков увеличивается. При рН ниже изоэлектрической точки белки имеют положительный заряд. 2.На растворимость белков существенное влияние оказывают следующие факторы: а) рН, б) ионная сила, в) диэлектрические свойства растворителя и г) температура. а) Влияние рН раствора на растворимость белков . При значении рН раствора, совпадающем с величиной рНИЭТ, белки будут обладают наименьшей растворимостью. Объясняется это тем, что в изоэлектрической точке суммарный заряд молекулы белка равен нулю, и, следовательно, между соседними молекулами белка отсутствует электростатическое отталкивание. При значениях рН, отличных от значений рНИЭТ, молекулы белка имеют суммарный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг от друга. На этом свойстве основан метод изоэлектрического осаждения белков. б) Влияние ионной силы на растворимость белков . При добавлении к растворам белка солей небольших концентраций растворимость многих белков повышается. Этот эффект зависит также от величины зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе: соли, содержащие двухзарядные ионы значительно эффективнее повышают растворимость белков, чем соли, содержащие однозарядные ионы. При значительном повышении концентрации солей растворимость белков начинает опять понижаться, и при очень высоких концентрациях соли белок может полностью выпасть в осадок (если рН среды совпадает с рНИЭТ) . Это явление называется высаливанием. Оба описанных эффекта, т. е. повышение растворимости белков при низких концентрациях соли и понижение при высоких концентрациях, широко используются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде. в) Влияние растворителя на растворимость белков . Добавление смешивающихся с водой нейтральных органических растворителей уменьшает растворимость большинства белков в воде до такой степени, что они могут выпадать в осадок (если при этом рН раствора совпадает с рНИЭТ) . Например, этанол или ацетон, являясь водоотнимающими веществами, понижают степень гидратации белков и уменьшают их растворимость. Кроме того, растворимость белков зависит от диэлектрической постоянной среды (при постоянных значениях рН и ионной силы) . С уменьшением диэлектрической постоянной растворителя силы притяжения между двумя молекулами белка возрастают, что способствует агрегации белков, т. е. снижает их растворимость. Эти закономерности используют для разделения белковых молекул. г) Влияние температуры на растворимость белков . В сравнительно узком интервале температур, приблизительно от 0 до 40°С, растворимость большинства белков возрастает с повышением температуры. При температурах, превышающих 40—50°С, большинство белков утрачивает стабильность, начинается их денатурация, сопровождающаяся обычно резким снижением растворимости. |