Количественная оценка гемопоэтического химеризма после трансплантации стволовых клеток Цель: Разработка, оптимизация и внедрение в лабораторную практику СЗФМИЦ методики количественной оценки гемопоэтического химеризма путем фрагментного анализа у больных перенесших ТГСК. Задачи: - Подбор STR локусов обладающих оптимальными характеристиками для детекции химерного гемопоэза.
- Подбор праймеров для установленной панели локусов.
- Подбор условий для качественной амплификации.
- Тестирование панели с детекцией результатов в агарозном геле.
- Подбор комбинаций локусов и оптимизация условий для multiplex PCR.
- Тестирование панели с детекцией результатов методом капиллярного электрофореза.
Принцип метода: Figure from Bone marrow transplantation (2004) 34, 1-12 Подбор локусов Short Tandem Repeat (STR): - D2S1360
- D7S1517
- D8S1132
- D9S1118
- D10S2325
- D11S554
- D12S1064
- D12S391
- MYCL1
- P450cyp19
- SE-33
- Amelogenin
Панель STR локусов
Локус
|
HI
|
PIC
|
EUC criteria
|
Combined Probability
|
D2S1360
|
0,8459
|
0,8324
|
0,4915
|
0,9942
|
D7S1517
|
0,8630
|
0,8492
|
0,4945
|
0,9886
|
D8S1132
|
0,8641
|
0,8487
|
0,3959
|
0,9997
|
D9S1118
|
0,8412
|
0,8221
|
0,5447
|
0,9774
|
D10S2325
|
0,8728
|
0,8595
|
0,4782
|
0,9970
|
D11S554
|
0,9424
|
0,9396
|
0,7115
|
0,9503
|
D12S1064
|
0,8485
|
0,8307
|
0,3331
|
0,9999
|
D12S391
|
0,8748
|
0,8629
|
0,4583
|
0,9991
|
MYCL1
|
0,9282
|
0,9242
|
0,4614
|
0,9914
|
P450cyp19
|
0,7649
|
0,7252
|
0,2850
|
0,9999
|
SE-33
|
0,9412
|
0,9380
|
0,8277
|
0,8277
| Table from Leukemia (2012) 26, 1821-1828
Локус
|
Сиквенс
|
Структура
|
Размер продукта амлификации
|
D2S1360
|
[TAGA]n[CAGA]n
|
Tetra
|
233-273 п.о.
|
D7S1517
|
[GAAA]n[CAAA]n
|
Complex
|
164-212 п.о.
|
D8S1132
|
[CTAT]n
|
Tetra
|
347-379 п.о.
|
D9S1118
|
[TATC]n
|
Tetra
|
92-128 п.о.
|
D10S2325
|
[TCTTA]n
|
Penta
|
163-213 п.о.
|
D11S554
|
[AG]n[AAAG]n
|
Complex
|
166-246 п.о.
|
D12S1064
|
[TGA]n[TAGA]n
|
Complex
|
114-142 п.о.
|
D12S391
|
[GATA]n[GACA]n
|
Complex
|
237-269 п.о.
|
MYCL1
|
[GAAA]n[GAAAA]n
|
Complex
|
156-225 п.о.
|
P450cyp19
|
[TATTT]n[TATT]n
|
Complex
|
314-464 п.о.
|
SE-33
|
[AAAG]n
|
Tetra
|
138-300 п.о.
|
Amelogenin
| | |
X=212; Y=218
| Экстракция ДНК: Целевое количество ДНК – 25 нг на одну реакцию амплификации Photo from www.chinahla.comEn_index.asp Параметры ПЦР ChimerXplain kit
Стадия__Температура_(С)__Время__Нагрев_и_охлаждение__Количество_циклов'>Стадия
|
Температура (С)
|
Время
|
Нагрев и охлаждение
|
Количество циклов
|
Активация полимеразы
|
95
|
11 min
| |
1 cycle
|
Предварительная денатурация
|
96
|
1 min
| |
1 cycle
|
Денатурация
|
94
|
30 sec
| |
9 cycles
|
Отжиг
|
60
|
30 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Элонгация
|
70
|
45 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Денатурация
|
90
|
30 sec
| |
21 cycles
|
Отжиг
|
60
|
30 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Элонгация
|
70
|
45 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Заключительная элонгация
|
60
|
30 min
| |
1 cycle
|
Хранение
|
4
| | | | Cycling conditions from User manual ChimerXplain Kit Параметры ПЦР
Стадия
|
Температура (C)
|
Время
|
Нагрев и охлаждение
|
Количество циклов
|
Предварительная денатурация
|
96 C
|
5 min
| |
1 cycle
|
Денатурация
|
96 C
|
30 sec
| |
35 cycles
|
Отжиг
|
60 C
|
30 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Элонгация
|
72 C
|
45 sec
|
R(RAMP)=1 C/sec
| |
Заключительная элонгция
|
60 C
|
15 min
| | |
Хранение
|
4 C
|
Forever
| |
1 cycle
| ДНК Полимераза – DreamTaq (Thermo Scientific) Концентрации праймеров
Локус
|
Концентрация праймеров
| | | |
Прямой
|
Обратный
|
D2S1360
|
400
|
400
|
D7S1517
|
400
|
400
|
D8S1132
|
200
|
200
|
D9S1118
|
400
|
100
|
D10S2325
|
200
|
200
|
D11S554
|
400
|
400
|
D12S1064
|
400
|
400
|
D12S391
|
400
|
400
|
MYCL1
|
400
|
400
|
P450cyp19
|
400
|
400
|
SE-33
|
400
|
400
|
Amelogenin
|
100
|
100
| Электрофорез в агарозном геле:
Плотность геля
|
Напряжение
|
Время
|
Буфер
|
2 %
|
150 V
|
170 мин
|
Tris-acetate-EDTA
| Капиллярный электрофорез: Figure from Leukemia (2001) 15, 303-306 Интерпретация результатов: Table from Leukemia (2012) 1821-1828 Основные критерии информативности аллельных “созвездий”: - Достижение величины пика более 6000 RFU (при использовании 10 нг ДНК)
- “Застревающие” пики должны составлять менее 1 % от общего массы сигналов
- Уровень шума должен составлять менее 50 RFU.
|
Скачать 1.98 Mb.