Анатомия пищевого сырья. Контрольная работа По Анатомии пищевого сырья (наименование дисциплины) на тему Методы исследования структуры клетки
 Скачать 272.9 Kb.
|
|
Электроды, чувствительные к определенным ионам, позволяют измерять их концентрацию только водной точке на клеточной поверхности. Если же ионы представлены в клетках в низкой концентрации, показания таких электродов зачастую оказываются ошибочными. Поэтому в таких случаях для регистрации используют внутриклеточные индикаторы, излучающие свет. Такими являются люминесцентные и флуоресцентные вещества, например, белок акварин или синтетические. Этим способом измеряют концентрацию ионов кальция и водородных ионов. Для введения в клетки молекул, не проникающих через мембрану (это могут быть светоизлучающие индикаторы, клеточные белки связанные с флуоресцентной меткой) используют микроинъекции молекул в клетки с помощью стеклянной микропипетки. Используя соответствующий микроскоп, исследователь получает возможность следить за поведением такого белка в процессе роста и деления клеток. Микроинъекции - весьма эффективный и достаточно широко используемый метод, однако важно помнить, что в данном случае процедуре микроинъекции подвергается каждая клетка отдельно, поэтому количество клеток ограничено. Для повышения проницаемости клеточных мембран применяют сильный электрический разрядили химическое воздействие. Электрический разряд создает большие порыв плазматической мембране, не повреждая внутриклеточные мембраны. В зависимости от типа клеток и интенсивности электрической стимуляции эти поры остаются открытыми в течение нескольких минут или даже часов. Через эти поры макромолекулы могут быстро входить в цитозоль или выходить из него. При ограниченном воздействии мембрана многих клеток восстанавливается и клетки выживают. Третий способ введения больших молекул в клетки — путем слияния окруженных мембраной частиц, содержащих необходимые молекулы, с плазматической мембраной клетки. Фракционирование клеточного содержимого Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности, в этом случае образец седиментирует в круговом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов непроисходит и они "застревают" на этом уровне. Ив центрифужной пробирке возникает набор различных полос, причем полосы прилежащие ко дну пробирки, содержат компоненты максимально плавучей плотности. Этот метод очень чувствителен, сего помощью можно отделять немеченые макромолекулы от макромолекул, содержащих тяжелые изотопы (С или Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами можно установить молекулярный механизм биологических процессов, поскольку лишь в этом случае исследуемых механизм может быть изучен в чистом виде без помех, создаваемых происходящими в клетке побочными реакциями. Использование бесклеточных систем принесло первый триумфальный успех при изучении механизмов биосинтеза белка. Отправной точкой в данном случае послужил неочищенный клеточный экстракт, способный транслировать молекулы РНК в белок. После многократного фракционирования этого экстракта были получены рибосомы, РНК и различные ферменты, составляющие в совокупности аппарат биосинтеза белка. После получения отдельных компонентов в чистом виде их можно было добавлять в систему и исключать из нее и таким образом уточнять роль каждого компонента в процессе биосинтеза белка. Белки обычно разделяют методом хроматографии на колонках. Так смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. Во взаимодействии с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. Как разные белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя, которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография, гидрофобности (гидрофобная хроматография, размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография). На каждом, этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более чем враз, и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок. Белки обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. Этот феномен лежит в основе электрофореза - метода разделения смесей белков в свободных водных растворах ив твердом пористом матриксе. Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Развертываясь, отдельные белковые молекулы освобождаются из комплексов с белками или молекулами липидов и солюбилизируются в растворе детергента. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряженных молекул детергента, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. Белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, и они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый, негативный заряд. Крупные белки, имеющие больший заряд, подвергаются действию значительных электрических сил, и даже существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты взаимно погашаются, нов порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно сильнее, чем малые белки. Вследствие этого сложная смесь белков делится наряд полос, расположенных в соответствии сих молекулярной массой. Используя красители, можно выявить основные фракции полипептидов. Антителами называют белки, продуцируемые позвоночными животными для защиты от инфекции. Каждая форма антител обладает определенными участками связывания, предназначеных для специфического узнавания молекул, стимулировавших синтез антител. Данные молекулы называют антигенами. Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для исследования биологии клетки. После окрашивания антител флуоресцирующими красителями их можно использовать для определения внутриклеточной локализации специфических макромолекул с помощью флуоресцентной микроскопии. Мечение электроноплотными микрочастицами, например микросферами коллоидного золота, позволяет использовать антитела для локализации клеточных антигенов при помощи электронной микроскопии. При связывании антител с инертным матриксом получают аффинные колонки, пригодные для выделения и очистки специфических молекул из грубых клеточных экстрактов. Антитела извлекают из сыворотки, обогащенной антителами, которую получают путем многократного введения антигена животным (например, кролику или козе. Эта антисыворотка содержит гетерогенную смесь антител, каждый тип которых был образован определенными клетками, синтезирующими антитела (В-лимфоцитами). Так как, плазматическая мембрана клеток непроницаема для крупных молекул, белки, расположенные внутри живых клеток, не могут взаимодействовать с антителами, добавляемыми извне. Если такие белки необходимо связать, в цитоплазму клеток эукариот можно ввести антитела и другие молекулы, инъецируя их тонкой стеклянной пипеткой через плазматическую мембрану. Прокалываемая плазматическая мембрана имеет способность "самозапаиваться" спустя некоторое время после инъекции. 4.Домикроскопический период Гистология человека — раздел медицины, изучающий строение тканей человека. Гистопатология — это раздел микроскопического изучения поражённой ткани, является важным инструментом патоморфологии (патологическая анатомия, так как точный диагноз рака и других заболеваний обычно требует гистопатологического исследования образцов. Гистология зародилась задолго до изобретения микроскопа. Первые описания тканей встречаются в работах Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия. В этот весьма продолжительный период (вплоть до XVIII впервые представления о тканях складывались на основании анатомических исследований трупов. В тоже время именно в этот период зарождалась и создавалась микроскопическая техника (применение увеличительных стекол и создание первых микроскопов) и накапливались первые отрывочные сведения о микроскопическом строении отдельных клеток. Первый прибор из увеличительных стекол был сконструирован около г. Гансом и Захарием Янсенами в Нидерландах (Голландия. В 1609 г. Галилео Галилей, используя дошедшие до него сведения об изобретении увеличительной трубы, сконструировал свой оптический прибор, который имел кратное увеличение. Его первая демонстрация в Венеции произвела громадное впечатление. Свою оптическую систему Галилей сначала применял для изучения строения различных предметов (1610-1614), а затем впервые обратил ее в ночное небо для рассмотрения небесных светил Термин микроскоп появился лишь в 1625 г. Первое его применение в естествознании связано с именем Роберта Гука , который в 1665 г. обнаружил и описал растительные клетки на срезе пробки, используя микроскоп собственной конструкции с увеличением в 30 раз. Большое значение для становления гистологии, эмбриологии и ботаники имели работы Марчелло Мальпиги (Malpighi, Marcello, 1628-1694) - итальянского врача, анатома и натуралиста. Ему принадлежит открытие капилляров (1661), завершившее работы У. Гарвея, и описание форменных элементов крови (1665). Его именем названы почечные тельца и слой эпидермиса. Значительный вклад в развитие микроскопии внес голландский натуралист-самоучка Антоны ван Левенгук (Leeuwenhoek, Antony van, 1632- 1723). Занимаясь шлифовкой оптических стекол, он достиг высокого совершенства в изготовлении короткофокусных линз, которые давали увеличение до 270 раз. Разрозненные наблюдения над клетками не сопровождались обобщениями и еще не привели к созданию науки. Первая попытка систематизации тканей организма (без применения микроскопа) была предпринята французским врачом Мари Франсуа Ксавье Биша), который считается основоположником гистологии как науки. Среди многообразия структур организма он выделил тканевую систему и подробно описал их в своих трудах Трактат о мембранах и оболочках и «Общая анатомия в приложении к физиологии и медицине. Наряду с хрящевой, костной и другими тканевыми системами он различал волосяную, венозную, кровеносную, которые (как это известно сегодня) являются структурами органного характера, а не тканевого. После смерти Биша, Ж- Н. Корвизар написал Наполеону Никто не сделал так много итак хорошо за такое короткое время». В XIX веке гистология была полноправной академической дисциплиной. В середине XIX века А. Кёлликер, Лейдинг и др. создали основы современного учения о тканях. Р. Вирхов положил начало развитию клеточной и тканевой патологии. Открытия в цитологии и создание клеточной теории стимулировали развитие гистологии. Большое влияние на развитие науки оказали труды И. И. Мечникова и Л. Пастера, сформулировавших основные представления об иммунной системе. Нобелевскую премию 1906 года в физиологии или медицине присудили двум гистологам, Камилло Гольджи и Сантьяго Рамон-и-Кахалю. Они имели взаимно-противоположные воззрения на нервную структуру головного мозга в различных рассмотрениях одинаковых снимков. В XX веке продолжалось совершенствование методологии, что привело к формированию гистологии в её нынешнем виде. Современная гистология тесно связана с цитологией, эмбриологией, медициной и другими науками. Гистология разрабатывает такие вопросы, как закономерности развития и дифференцировки клеток и тканей, адаптации на клеточном и тканевом уровнях, проблемы регенерации тканей и органов и др. Достижения патологической гистологии широко используются в медицине, позволяя понять механизм развития болезней и предложить способы их лечения. Несмотря на крупные достижения в области современной биологии клетки, непреходящее значение для развития идей о клетке имеет клеточная теория. В 1838 г. немецкий зоолог-исследователь Т. Шванн впервые указал на гомологичность, или сходство, клеток растительных и животных организмов. Позже он сформулировал клеточную теорию строения организмов. Поскольку при создании этой теории Т. Шванн широко использовал результаты наблюдений немецкого ботаника М. Шлейдена, последнего по праву считают соавтором клеточной теории. Стержнем теории Шванна-Шлейдена является тезис о том, что клетки представляют собой структурно-функциональную основу всех живых существ. Вопрос о пределе делимости материи издавна волновал человечество. Еще древнегреческий натурфилософ Демокрит (460-370 гг. дон. э) предсказал существование атомов – частиц, неделимых без потери качества. Во второй половине XVII в. немецкий философ Готфрид Вильгельм Лейбниц создал учение о монадах. Монада – это мельчайшая частица, отражающая все свойства целого. Таким образом, Лейбниц предсказал существование элементарной биологической системы, обладающей всеми свойствами жизни. В настоящее время бурно развивается концепция фракталов (Бенуа Мандельброт, 1982). Фракталы – это самоподобные структуры, состоящие из элементов, подобных целому. Открытие и дальнейшее изучение клетки стало возможным только после изобретения микроскопа. Это связано стем, что человеческий глаз неспособен различать объекты с размерами менее 0,1 мм, что составляет 100 микрометров (сокращ. микрон или мкм). Размеры же клеток (а тем более, внутриклеточных структур) существенно меньше. Например, диаметр животной клетки обычно не превышает мкм, растительной – 50 мкм, а длина хлоропласта цветкового растения – не более 10 мкм. С помощью светового микроскопа можно различать объекты диаметром в десятые доли микрона. Поэтому световая микроскопия является основным, специфическим методом изучения клеток. 5.Микроскопический период Период систематических микроскопических исследований тканей открывается одним из крупнейших обобщений естествознания XIX в- клеточной теорией строения организмов. В основных своих чертах клеточная теория была сформулирована в трудах немецких ученых - ботаника Матиаса Шлейдена, и зоолога Теодора, Шванна. Их предшественниками были Р. Тук, М. Мальпиги, А. ван Левенгук, Ж. Ламарк. В 1838 г. М. Шлейден в своей статье Материалы к фитогенезу» показал, что каждая растительная клетка имеет ядро, и определил его роль в развитии и делении клеток. В 1839 г. был опубликован основополагающий труд Т. Шванна Микроскопическое исследование о соответствии в строении и росте животных и растений, в котором он определил клетку как универсальную структурную единицу растительного и животного мира, показал, что растительные и животные клетки гомологичны по своей структуре, аналогичны по функции, и дал основные характеристики их образования, роста, развития и дифференцировки. Одним из основоположников учения о клеточном строении был Ян Эвангелист Пуркине - чешский естествоиспытатель и общественный деятель, основатель пражской гистологической школы, почетный член многих зарубежных академий науки научных обществ (в том числе в Петербурге и Харькове. Пуркине первым увидел нервные клетки в сером веществе головного мозга (1837), описал элементы нейроглии, выделил в сером веществе коры мозжечка крупные клетки, названные впоследствии его именем, открыл волокна проводящей системы сердца (волокна Пуркине). Он первым применил термин протоплазма (1839). В его лаборатории создан один из первых микротомов. Я- Э. Пуркине был организатором чешского Научного общества врачей, которое ныне носит его имя. Клеточная теория дала ключ к изучению законов строения и развития различных органов и тканей. На этой основе в XIX в. была создана микроскопическая анатомия как новый раздел анатомии. К концу в. в связи с успехами в изучении тонкого строения клетки были заложены основы цитологии. Успехи гистологии как науки о строении и происхождении тканей и их компонентов прежде всего связаны с развитием техники, оптики и методов микроскопирования. Микроскопические исследования позволили накопить данные о строении клеток и тканей организма и на этом основании сделать теоретические обобщения. Первые микроскопы были созданы вначале в.Одно из самых ранних научных исследований с помощью микроскопа собственной конструкции провел английский ученый Роберт Гук (1635-1703). Он изучал микроскопическое строение многих предметов, среди которых были острие иглы, батист, песок в моче, семена мака, муравьи, древесина и многие другие. Все изученные объекты Р. Гук описал в книге «Микрография или некоторые физиологические описания мельчайших тел, выполненные при посредстве увеличительных стекол, изданной в 1665 г. Из своих наблюдений Р. Гук сделал вывод о широком распространении пузырьковидных ячеек в растительных объектах и впервые предложил термин клетка. В 1671 г. английский ученый Н. Грю (1641-1712) в своей книге Анатомия растений писало клеточном строении как о всеобщем принципе организации растительных организмов. Н. Грю впервые ввел в употребление термин ткань для обозначения растительной массы, поскольку последняя напоминала по своей микроскопической конструкции ткани одежды. В том же году итальянец Дж. Мальпиги (1628-1694) дал систематическое и детальное описание ячеистого (клеточного) строения различных растений. В дальнейшем постепенно накапливались факты, |