|
|
Анатомия пищевого сырья. Контрольная работа По Анатомии пищевого сырья (наименование дисциплины) на тему Методы исследования структуры клетки
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования«Мичуринский государственный аграрный университет»Шифр Контрольная работаПоАнатомии пищевого сырья(наименование дисциплины)на тему:Методы исследования структуры клетки История развития учения о тканях (тема или номер варианта)Выполнил(а):студент(ка) группы ФЗБ11ОП Тамбовского филиаланаправленияподготовки:19.03.04«Технологияпродукции и организации общественного питания»(название направления)Королёва Яна Юрьевна (ФИО)Проверил(а):/ /(ФИО)(подпись) Тамбов 2022
Содержание
Введение 3 1. Световая микроскопия и ее возможности. Обычная оптическая микроскопия 1.2. Флуоресцентная микроскопия 1.3. Электронная микроскопия 1.4. Рентгеноскопия 2. Использование ядерного магнитного резонанса
(ЯМР) для определения химических условий в живых клетках 2.1. Использование внутриклеточных электродов 2.2. Использование светоизлучающих индикаторов 3. Фракционирование клеточного содержимого 4.Домикроскопический период 5. Микроскопический период Развитие гистологии и эмбриологии в России
24
Заключение
30
Список используемой литературы 2
Введение Клетки достаточно малы по размеру и сложно устроены трудно рассмотреть их структуру, определить молекулярный состав и еще сложнее установить, как функционируют их отдельные элементы. Успехи в изучении биологии клетки, включая наиболее удивительные достижения последних лет, связаны с применением новых методических подходов. И, для понимания клеточной биологии необходимо иметь некоторое представление о соответствующих экспериментальных методах. Главнейшими группами тканей, из которых построены вегетативные (непосредственно несвязанные с размножением) органы высшего растения, являются следующие покровные, основные, механические, проводящие, выделительные, меристематические. В каждую группу обычно входит несколько тканей, имеющих похожую специализацию, но построенных по-своему из определенного вида клеток. Ткани в органах не изолированы друг от друга, а составляют системы тканей, где элементы отдельных тканей чередуются. Гистоло́гия (от греч. ίστίομ — ткань и греч. Λόγος — знание, слово, наука) — раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. Обычно это делается рассечением тканей на тонкие слои и с помощью микротома. Гистология – наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей живых организмов. А значит, гистология изучает один из уровней организации живой материи – тканевый. В гистологии имеется несколько разделов, изучающих определенные уровни организации живой материи, начиная с клеточного и заканчивая органными системным, составляющим организм.Организм человека и животных представляет собой целостную систему, в которой можно выделить ряд иерархических уровней организации живой материй клетки ткани — морфофункциональные единицы органов — органы системы органов. Каждый уровень структурной организации имеет морфофункциональные особенности, отличающие его от других уровней. Световая микроскопия и ее возможности Обычная оптическая микроскопия В случае излучение данной длины волны может быть использовано для изучения только таких структур, минимальные размеры которых еще сопоставимы с длиной волны самого излучения. Этот принцип ограничивает возможности любого микроскопа. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, которая для видимого света лежит в пределах от 0,4 мкм (фиолетовый) до 0,7 мкм (темно-красный). Из этого следует, что самыми маленькими объектами, которые еще можно наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (их ширина 0,5 мкм. Более мелкие элементы клетки искажаются эффектами, вызванными волновой природой света. После фиксации ткани обычно режут на очень тонкие "ломтики" (срезы) на микротоме. Срезы толщиной от 1 до 10 мкм помещают на поверхность предметного стекла. В качестве заключающих сред используют парафин или специальную смолу. В жидком виде эти среды пропитывают и окружают фиксированную ткань затем они затвердевают при охлаждении или за счет полимеризации, образуя твердый блок, который удобно резать на микротоме. Присутствует опасность того, что процедуры фиксации или заключения могут повредить структуру клеток или клеточных макромолекул. Вот почему предложен другой метод приготовления срезов - быстрое замораживание. Замороженную ткань режут на криостате в специальном микротоме, установленном в холодной камере В содержимом большинства клеток, состоящих, как правило, на из воды, практически отсутствуют компоненты, способные помешать прохождению световых лучей. Поэтому в естественном состоянии большинство клеток даже после фиксации и приготовления срезов практически невидимы в обычном световом микроскопе. Одна из возможностей их увидеть состоит в окраске клеток красителями Флуоресцентная микроскопия Поскольку большинство макромолекул представлены в клетках относительно незначительным числом копий, одна или две молекулы красителя, связанные с макромолекулой, могут оставаться незамеченными. Альтернативный подход к проблеме чувствительности состоит в использовании флуоресценции. Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если, такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. К примеру, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспецифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой, либо внутри фиксированной клетки. Для этой цели обычно используют два красителя - 5 флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом. Электронная микроскопия Взаимосвязь длины волны света и предела разрешения сохраняется для любой формы излучения, как для световых лучей, таки для электронов. Однако в последнем случае предел разрешения существенно ниже. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронном микроскопе с напряжением 100000 В длина волны электрона равна 0.004 нм, а согласно теории, разрешение такого микроскопа составляет 0,002 нм. Источник излучения - нить катода, испускающая электроны с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Поскольку при столкновении с молекулами воздуха электроны рассеиваются, в колонне должен быть создан вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в световом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают в вакуум колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается согласно плотности вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и образует изображение на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране. В электронном микроскопе нельзя наблюдать живые объекты. Поэтому ткани фиксируют, сшивая клетки и клеточные структуры глутаральдегидом, а затем обрабатывают осмиевой кислотой. Образцы обезвоживают, фиксируют смолами и нарезают тонким стеклянным или алмазным ножом. Тонкие срезы практически являются двумерными срезами ткани и не позволяют судить о трехмерной структуре клеточных компонентов. Трехмерное изображение можно получить, после реконструкции сотен серийных срезов. Один из них состоит в изучении образца под сканирующим электронным микроскопом. В этом случае, образец должен быть зафиксирован, высушен и покрыт тонкой пленкой тяжелого металла. После чего, образец сканируется очень узким пучком электронов. И происходит формирование единого, цельного и значительно увеличенного изображения. Метод сканирующей электронной микроскопии обеспечивает значительную глубину фокусировки и поскольку масштабы рассеивания электронов определяются углом поверхности по отношению к лучу, на изображении возникают чередующиеся светлые и темные участки, создающие впечатление трехмерности. Но этот метод применим только для изучения поверхности и его разрешение сравнительно невелико (около нм с эффективным увеличением примерно 20 тыс. раз. Данный метод используется только для изучения целых клеток и тканей. Просвечивающий электронный микроскоп можно использовать для изучения поверхности образца сочень большим увеличением, наблюдая отдельные макромолекулы. Как и при сканирующей электронной микроскопии, на высушенный образец напыляется тонкая пленка тяжелого металла. Металл напыляется под определенным углом, так что отложения напыленной пленки в некоторых местах толще, чем в других. Этот процесс известен как оттенение - здесь возникает эффект тени, создающий впечатление трехмерности изображения. В клеточной биологии особенно успешно используются два метода, основанные на получении механических реплик. Один из них - метод электронной микроскопии "замораживание-скалывание" - дает возможность изучать внутреннее строение клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота (С. Замороженный блок затем раскалывают лезвием ножа. Скол часто проходит через гидрофобную середину двойного слоя липидов, обнажая внутреннюю поверхность клеточных мембран. Образующуюся поверхность скола оттеняют платиной, органический материал удаляют и изучают полученные реплики в электронном микроскопе. Метод "замораживания - травления" используется для изучения внешней поверхности клеток и мембран. В данном случае клетки замораживают при очень низкой температуре и замороженный блок раскалывают лезвием ножа. Содержание льда вокруг клеток (ив меньшей степени внутри клеток) понижают возгонкой воды в вакууме при повышении температуры (процесс называют вакуумной сушкой. Участки клетки, подвергнутые такому травлению, затем оттеняют для приготовления платиновой реплики. В настоящее время можно наблюдать с высоким разрешением даже внутренние детали трехмерных структур, таких, как вирусы. Для этого используют метод криоэлектронной микроскопии, где очень тонкий (примерно 100 нм, быстрозамороженный слой влажного образца помещают на микроскопическую решетку. С помощью специального приспособления гидратированный образец удерживают при - 160сС в вакууме микроскопа. Таким способом можно наблюдать материал практически непосредственно без фиксации, окраски и сушки. Рентгеноскопия Рентгеновские лучи, подобно свету, являются одной из форм электромагнитного излучения, но, длина волны рентгеновских лучей значительно короче, их применение позволяет разрешить значительно более мелкие детали. В отличие, от видимого света или потока электронов рентгеновские лучи нельзя сфокусировать и после их прохождения через образец получить обычное изображение. Но структуру можно выявить - используя метод дифракции рентгеновских лучей. Рассеянное излучение можно рассматривать как набор перекрывающихся волн, каждая из которых отражается разными участками объекта. Если волны перекрываются, они подвергаются интерференции и возникает распределение излучения, известное как дифракционная картина. Дифракционная картина может быть зарегистрирована на фотопластинке, помещенной на некотором расстоянии от предмета, или представлена с помощью количества рассеянного излучения, отраженного объектом в разных направлениях. Форма дифракционной картины определяется структурой объекта. С другой стороны, исходя из полного описания дифракционной картины, можно теоретически рассчитать структуру данного объекта Полная дифракционная картина кристаллической решетки будет состоять из множества ярких пятен различной интенсивности. Относительная интенсивность различных пятен в дифракционной картине зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. В действительности интенсивность данного пятна пропорциональна интенсивности излучения, которое будет отражаться в данном направлении от характерного одиночного объекта. Для того, чтобы достичь высокого разрешения, нужно иметь кристаллы с высокой степенью упорядоченности. По мере прохождения через образец рентгеновские лучи рассеиваются электронами атомов, составляющими образец. Поэтому большие атомы с большим количеством электронов рассеивают рентгеновские лучи более эффективно, чем небольшие атомы, так что атомы СОР регистрируются гораздо более надежно, чем атомы Н. 9 2. Использование ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для определения химических условий в живых клетках Ядра многих атомов характеризуются магнитным моментом они обладают внутренним магнетизмом. Магнитные характеристики этих атомов подвержены влиянию со стороны окружающих атомов. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР, являющийся безвредным для живых клеток, позволяет определить химическую природу вещества. Если ядра атомов, обладающие магнитным моментом, поместить в магнитное поле, они принимают одну из возможных ориентации. Каждая из ориентации характеризуется энергией, определяемой силой поля и химическим окружением. При облучении радиоволнами набора атомов в идентичном химическом окружении, энергия этих волн будет в значительной степени абсорбироваться, если волны обладают строго определенной частотой, соответствующей разности энергетических состояний двух возможных ориентации ядер в магнитном поле. Это так называемая резонансная частота. Образец ткани содержит атомы в различных молекулах, в различном окружении, поэтому он будет поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. Такой спектр отражает структуру и относительное содержание каждого типа молекул, содержащих магнитные ядра. Для изучения макромолекул, содержащихся внутри живой клетки, обычно используют широко распространенные изотопы Ни редкие изотопы l3C и l5N. Ввиду важной роли соединений фосфора, которую они играют в метаболизме, эффективным оказывается определение ЯМР 31Р. Этот изотоп в норме присутствует в фосфорсодержащих веществах клеток. Сигналы, создаваемые им, можно использовать для слежения за изменением внутриклеточной концентрации в процессе мышечного сокращения таких соединений, как АТР и неорганический фосфат Редкие изотопы Си в норме не содержатся в клетках в достаточных количествах, однако их можно вводить в специфические макромолекулы, имеющие биологическое значение. С помощью ЯМР удается следить впоследствии за их химической трансформацией. Если, например, выращивать клетки на среде с глюкозой Сто, измеряя в течение некоторого времени спектр ЯМР образца, можно определять скорость многих реакций, в которых участвует глюкоза. Главным ограничением метода ЯМР является его низкая чувствительность. Например, для определения содержания какого-либо соединения с использованием современных модификаций метода 31Р-ЯМР, в грамме живой ткани должно содержаться не менее 0,2 мМ исследуемого соединения. Однако многие метаболиты присутствуют в живых тканях в более низких концентрациях. Более того, поскольку для снятия одного спектра ЯМР требуется, как правило, несколько минут, можно не уловить быстрые изменения цитохимических характеристик. С другой стороны, значительное преимущество ЯМР состоит в его безвредности для живых клеток, и это обстоятельство делает данный метод весьма перспективным для клеточной биологии. Использование внутриклеточных электродов Для изучения отдельных клеток необходимо использовать методы более чувствительные, чем ЯМР. Один из них основан на подходе, разработанном электрофизиологами для изучения разности потенциалов и тока на плазматической мембране. С этой целью готовят внутриклеточные микроэлектроды. Они состоят из тонких стеклянных трубок, диаметр конца которых измеряется долями микрона такие трубочки заполняют электропроводным раствором (обычно это раствор соли КС1 в воде). Кончик микроэлектрода вводят в цитоплазму через плазматическую мембрану, которая смыкается вокруг капилляра, плотно прилегая к стеклу, так что клетка остается относительно неповрежденной
В
исследовании клеточного содержимого микроэлектроды используют двояко сих помощью можно измерять внутриклеточную концентрацию обычных ионов, таких, как ионы Ни. Они могут быть использованы и для инъекции молекул в клетки.
Микроэлектродную технику используют для изучения транспорта ионов через специализированные белковые каналы (именуемые также ионными каналами, содержащиеся в небольших участках плазматической мембраны. В этом случае необходим стеклянный микроэлектрод с несколько более толстым кончиком. Его не вводят в плазматическую мембрану, а плотно и мягко прижимают к ней. Что позволяет регистрировать электрические характеристики небольшого участка мембраны, прилегающего к кончику микроэлектрода, который, в свою очередь, прикасается к клетке или находится на небольшом расстоянии от нее. Данный метод известен как "пэтч-регистрация" (регистрация в данном участке).
Его применение произвело настоящую революцию в
исследовании ионных каналов. Это едиственный метод клеточной биологии, который дает возможность изучать функцию одиночной белковой молекулы в реальном времени Использование светоизлучающих индикаторов
|
|
|
Скачать 272.9 Kb.