Протокол №3. Лабораторлы Жмыс 3 Таырыбы Шигеллезді бактериологиялы диагностикасы
 Скачать 0.61 Mb.
|
|
ЛАБОРАТОРЛЫҚ ЖҰМЫС №3 Тақырыбы: Шигеллездің бактериологиялық диагностикасы Мақсаты: шигеллезді диагностикалаудың микробиологиялық әдістерін меңгеру Студент білуі керек 1.Шигеллезді микробиологиялық диагностикалау әдістері. Студент жасай білуі керек 1. Микробиологиялық зерттеудің бағыты мен нәтижесін жазу; 2. Науқастың нәжісін Плоскиревтің селективті ортасына себу; 3. Shigella тұқымдас бактериялардың өскен колонияларын сипаттаңыз; 1. Shigella тұқымдас бактериялардың боялған жағындыларының микроскопиясының нәтижелерін бағалауды жүргізу; 2. Shigella тұқымдас бактериялардың өскен колонияларын Рессель ортасына себу; 3. Рессель ортасының түсінің өзгеруінің нәтижелерін бағалау; 4. Поливалентті дизентериялық сарысуы (№1 қоспасы) және түрлік сарысуы (Флекснер, Ньюкестль, Зонне) бар шыныға агглютинация реакциясын қою. Негізгі теориялық ережелер Бактериялық дизентерия немесе шигеллез - бұл тоқ ішектің зақымдануы, колиттің дамуы және ағзаның интоксикациясы тудыратын жұқпалы ауру. Қоздырғышы – Shigella туындысына жататын бактериялар: • Shigelladysenteriae (группа А); • Shigellaflexneri (группа В); • Shigellaboydii (группа С); • Shigellasonnei (группа D). Шигеллалар-ұсақ, қозғалмайтын,грам-теріс таяқшалар.Биохимиялық тұрғыдан белсенді емес: лактозаны ыдыратпайды, тек глюкозаны қышқылға дейін ыдыратады; Shigelladysenteriae қоспағанда, басқа түрлер маннитолды ыдыратады, күкірттісутек түзбейді. Shigellasonnei ең жоғары биохимиялық белсенділікке ие болып табылады.  Сурет. Дизентерия қоздырғыштары Шигеллалардың барлық түрлері тоқ ішектің шырышты қабатын инвазияланып, кейінен жасуша аралық кеңістікке таралады. Бұл қабілет трипсинге сезімтал инвазин - ақуыздардың синтезін және микроорганизмнің жасушааралық кеңістіктер арқылы таралу факторын анықтайтын ірі плазмидамен байланысты. Сонымен қатар, барлық шигеллалар эндотелийге әсер ететін нәруыз шигалары мен шига тәрізді цитотоксиндер шығарады, нәтижесінде нәжісте қан пайда болады. Шигеллезді зертханалық диагностикалау бактериологиялық әдіспен жүзеге асырылады. Патогенездің ерекшеліктеріне сәйкес шигелла тоқ ішектің эпителий жасушаларында локализацияланған, сондықтан бактериологиялық зерттеудің негізгі материалы ішек қозғалысы немесе мақта-дәке тампонымен,тік ішек ілмегімен алынған тоқ ішек материалы болып табылады. Шигеллаларды анықтау үшін нәжісті жинау кезінде мыналарды ескеру қажет: • Шигеллалар негізінен шырыш пен іріңде болады, сондықтан шырыш пен ірің бар сынамалар алынады. • Нәжістің алғашқы бөліктері-бұл микроорганизмдер өліп кетуі мүмкін ішектің төменгі бөлігіндегі тығын, сондықтан егу үшін тік және сигма тәрізді ішектің жоғарғы бөлігінен алынған нәжістің бөліктері таңдалады. • Зерттеу үшін ішектің төменгі бөлігі болып табылатын нәжістің соңғы, сұйық бөліктерін алуға болмайды. • Шигеллаларды анықтау үшін нәжісті тікелей себеміз, егер ол тікелей палатада ғана орындалса жүзеге асырылуы мүмкін, әйтпесе ашыту процестері тұрақты нәжісте пайда болады да, бұл қышқыл реакцияны тудырады,ал онда шигелла өледі. Тасымалдау ортасы қызметін байыту ортасы атқарады (20% өт және селенит сорпалары). Консервант-глицерин қоспасы (химиялық таза глицерин және натрий хлоридінің изотониялық ерітіндісі). Енгізілетін нәжістің көлемі тасымалдау ортасының көлемінің 1/5 аспауы тиіс. Зертханаға жеткізілгеннен кейін тасымалдау ортасында материал дифференциалды элективті тығыз ортаға себіледі. Консервантқа жеткізілген нәжіс 4°С температурада себілгенге дейін сақталады.  Сурет. Флекснер шигеллаларының сорпадағы өсімі Егу бір уақытта бірнеше ортада - Плоскирев, Эндо, Левин жүзеге асырылады. 1904 жылы Эндо тифоидты таяқшаларды нәжістен анықтау үшін қоректік орта ойлап тапты, ол кең практикалық қолданысқа ие болды. Қазіргі уақытта бактериологтар арасында Эндо қоректік ортасы кеңінен танымал – ол адамдар мен жануарлардың ауруларын диагностикалау үшін және биоматериалды біріншілік себу кезінде сыртқы орта объектілері және тамақ өнімдерінің патогендік энтеробактериялармен тұқымдануы кезінде қолданылады. Эндо ортасы ингибиторы ретінде грам оң микроорганизмдердің натрий сульфитін және негізгі фуксинді қамтиды. Эндо ортасының құрамына ет пептоны, екі алмастырылған натрий ортофосфаты, фуксин, лактоза, натрий сульфиті және агар кіреді. Эндо ортасының саралау қасиеттері микроорганизмдердің лактозаны ашыту қабілетіне негізделген. Лактозаны ашытпайтын микроорганизмдер, ортада түссіз мөлдір колонияларды құрайды. Лактоза оң микроорганизмдер ацетальдегид пайда болғанға дейін лактозаны ашытады, ол натрий сульфитімен әрекеттесіп, колонияларды қызыл түске бояйды. Натрий сульфиті мен негізгі фуксиннің болуына байланысты ортада оң грам микрофлораның өсуі мүлдем жоқ.  Сурет. Нәжісті себуден кейін Эндо ортасында металл жылтырлығы бар эшерихия (таңқурай) және шигелла (түссіз) колониялары. Левиннің дифференциалды диагностикалық ортасы - эозин-метилен көк қоректік орта. Бұл орта дизентерия, іш сүзегі, сальмонеллез және басқа ішек инфекцияларын зертханалық диагностикалауда қолданылады. Алғаш рет эозин мен метилен көк агарын 1916 жылы Холт-Харрисоми Тиг ұсынған (J. E. Holt-Harris,O. Teague), кейінірек, 1918 жылы орта құрамы Левинмен өзгертілген. Ол тек пептонды негіз ретінде пайдаланып, оған буферлік жүйе ретінде бір алмастырылған калий фосфатын қосып, бастапқы құрамды жеңілдетті, ол сахарозаны орта құрамынан шығарып, лактоза концентрациясын арттырды. Дифференциялау қабілеті лактоза бактериялары ашыту кезінде түзілетін қышқылдың әсерінен рН өзгеруіне негізделген. Индикатор кешені рН 4,7-де тұнбаға түседі, қышқыл түзетін бактериялардың колонияларын қою көк-күлгін, қара дерлік, көбінесе жасыл жылтырмен бояйды. Лактозаны ашытпайтын бактериялар түссіз немесе қызғылт түсті колониялар түзеді. Левин ортасы (агар эозин және метилен көк агар) келесі құрамнан тұрады: пептон немесе желатиннің панкреатиялық гидролизаты, лактоза, екі алмастырылған калий фосфаты, эозин, метиленді көк, агар.  Сурет. Левин ортасында микроорганизмдердің өсуі.a-E. coli, b-S. flexneri. Плоскирев ортасы 1-ші кезеңде энтеробактериялардың таза культурасын анықтау үшін қолданылады; лактоза ашыту негізінде бактерияларды дифференциялауға мүмкіндік береді. Орта құрамында ингибиторлардың (өт қышқылдарының тұздары, йод, индикаторлар) болуына байланысты орта грам оң микрофлораның өсуін тежеуі тиіс. Лактоза теріс бактериялар (шигелла, сальмонелла) осы ортада түссіз колониялар түрінде өседі. Лактоза оң бактериялар (эшерихия) таңқурай түсті колонияларды түзеді. Ортаның дифференциациялық қасиеттері таңқурай түсті бейтарап қызыл колония индикаторының арқасында, Плоскирев-ГРМ агарында түзетін лактозо ашыту бактерияларының өсуімен, рН-ның қышқыл жағына өзгеруіне негізделген.
 Сурет. Лакто теріс бактериялар (шигелла және сальмонелла) түссіз. Лактозо оң бактериялар (эшерихия) – таңқурай түсі. Рессель ортасы ішек тобының теріс бактерияларының грамдарын, әсіресе эшерихий, сальмонелла және шигеллаларын глюкоза мен лактозаны ашыту қабілетіне қарай дифференциялау үшін қолданылады. Инкубация кезінде қышқылдың түзілуі қиғаш бөліктегі фенолдық қызыл түстің (аэробты ашыту) және орта бағанындағы (анаэробты ашыту) индикатор түсінің өзгеруімен анықталады. Ашыту кезінде газдың пайда болуы бағандағы көпіршіктер мен орта үзілістерінен байқалады. Талдау нәтижелері бойынша бактериялар үш топқа бөлінеді: лактоза ферменттеуші, глюкоза ферменттеуші және көмірсуларды ферменттей алмайтын бактериялар. Үлгілер 19-20 сағаттан кейін талданады, өйткені олар орта компоненттерінің кезең-кезеңмен ферменттеуіне байланысты қате болуы мүмкін. Міндетті түрде бір сынама пробирканы қалдырады (бастапқы түсі-жасыл). Лактозаны ашытатын микроорганизмдердің өсуімен ортаның рН қышқыл жағына ауысады және агардың қиғаш бөлігінің сарғаюы, глюкоза – орта бағанының сарғаюы байқалады. Лактоза мен глюкозаны ферменттей алмайтын микроорганизмдердің өсуі сілтіленумен қатар жүреді, орта индикаторы көк түске айналады немесе бастапқы жасыл түс сақталады. S. flexneri – бағанның сарғаюы және қиғаш бөліктің көк түске боялуы. S. paratyphi – бағанның газ түзе сарғаюы және қиғаш бөліктің көк түске боялуы. E. coli – бүкіл ортаның газ түзілумен сарғаюы. Alcaligenesfaecalis – бүкіл ортаның немесе тек қиғаш бөліктің көк түске боялуы.  Сурет. Энтеробактериялардың Рессель ортасындағы өсімі Шигеллалардың бөлінген культураларын идентификациялау үшін 3-кезеңде поливалентті сарысуы бар шыныға агглютинация (РА) реакциясын жүргізеді (егер реакция оң болса, одан әрі түрлік сарысуларымен). Диагностикалық лиофилизацияланған иммундық сарысулар формалин немесе мертиолятпен инактивтендірілген, шигелл антигендерімен гипериммундалған, қояндардың немесе қошқарлардың қанынан алынады. Адсорбцияланған сарысуларда гомологиялық антигендері бар шигелла культураларын агглютинациялауға тиісті антиденелер бар және гетерологиялық антигендері бар шигелла культураларын агглютинацияламайды. Жұмыстың орындалу барысы Бактериологиялық зерттеу мынадай негізгі кезеңдерді қамтиды: бастапқы материалды дифференциалды-диагностикалық және элективті ортаға себу, күдікті колонияларды іріктеу, таза дақылдардың жинақталуы және оларды идентификациялау. . Этап. Науқастың нәжісі Плоскирев ортасына себіледі. . Этап. Алғашқы егуден кейін дақылдарды 18-20 сағаттан кейін қарайды. Плоскирев және эндо орталарында шигеллалар түссіз, мөлдір немесе жартылай мөлдір, дөңгелек, дөңес, тегіс шеті бар (S-пішінді) диаметрі 1-4 мм колонияларды құрайды. Схема бойынша түссіз колонияларды сипаттау. Жағынды жасау, Грам бойынша бояу, микроскопиялау. Мұндай колониялардан алынған материалды бактериоскопиялағанда, жаңа клиникалық материалдарда кейде коккобациллаларға ұқсайтын грам-теріс қысқа таяқшалардың болуы анықталады. Шигеллаларға тиісті күдікті колонияларды Рессель ортасы бар пробиркаға қайта егеді. 3.Этап. Алдыңғы күнгі дақылдардың нәтижелерін талдау. Шигелла қатарына жататын микроорганизмдер глюкозаны қышқылға дейін ашытуға бейім (S. flexneri, 6 сероварынан басқа. Лактозаның ашытуы 2-3 күнде S. sonnei штамдарында байқалады. ФЗН (Флекснер, Зонне, Ньюкастл) поливалентті сарысуы бар әйнекке агглютинация реакциясын жүргізеді. Соңғы қорытынды ферментативті қасиеттерді және агглютинация реакциясын зерттеу нәтижелері бойынша 3-ші күнде беріледі, зерттеу нәтижелері бланкісіне жазылады. ПРОТОКОЛ №3 Дизентерия кезінде бактериологиялық зерттеу
Материалдар мен құрал-жабдықтар: вакутейнердегі нәжіс, спиртовка, бактериологиялық ілмек, пробиркаларға арналған штатив, таза заттық шынылар, препараттарды бояуға арналған шыны "көпірі" бар науа, сүзгіш қағаз, шыныдағы қарындаш (стеклограф), дезинфекциялаушы ерітінді, Плоскирев ортасы бар Петри тостағандары, Рессель ортасы бар пробиркалар, термостат, иммерсиялық объективі бар биологиялық микроскоп, иммерсиялық май, грам бойынша бояғыштар жиынтығы, поливалентті дизентериялық сарысу, түрлік сарысулар (Флекснер, Ньюкестль, Зонне). Әдебиет: Микробиология, вирусология және иммунология, зертханалық жұмыстарға арналған нұсқаулық. Оқу құралы / / профессор В.Б. Сбойчаковтың редакциясымен, доцент м. м. Карапац, - ГЭОТАР-Медиа, - 2012,- С. 177-180. Микробиология, вирусология. Практикалық сабақтарға арналған нұсқаулық. Ресей ғылым академиясының академигі РАН В.В.Зверев және проф. М.Н.Бойченко редакциясымен, - ГЭОТАР-Медиа, - 2015,- Б. 207-211. 3. Микробиология бойынша зертханалық сабақтарға арналған нұсқаулық. Профессор Л. Б. Борисов редакциясымен - Мәскеу "Медицина",-1984, С179-181. |