отчет по лабораторной работе Ксенобиохимия_осаждение белка. лабораторная 1 по ксенобиохимии. Лабораторная работа 1 осаждение белков приборы и оборудование Штатив с пробирками Спиртовка Держалка
 Скачать 49 Kb.
|
|
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ Приборы и оборудование: Штатив с пробирками Спиртовка Держалка Цель работы: 1.1 Осаждение белка при кипячении. Выпадение белков в осадок при нагревании - свертывание - характерно практически для всех белков. Выпадение белка из раствора легче всего происходит в изоэлектрической точке, которая для большинства белков находится в пределах рН 4,5 - 6,0, то есть при слабокислой реакции. В нейтральной и сильнокислой средах осаждение белка идет значительно хуже, а в щелочной среде не наблюдается вовсе. Ход работы: В 4 пробирки наливают по 10 капель(примерно 0,5 мл) раствора белка. В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают. Опалесценция усиливается еще до того, как жидкость закипит. При кипячении может выпасть осадок. Растворы белков кипят неровно, толчками, так как белок по стенкам свертывается и в этих местах происходит перегревание, поэтому нагревание надо проводить осторожно, все время встряхивая пробирку. Усиление опалесценции объясняется укрупнением взвешенных частиц белка. Они удерживаются во взвешенном состоянии, так как эти частицы несут заряд. К нейтральному раствору белка во второй пробирке прибавляют 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты (до слабокислой реакции на лакмус), осадка при этом не образуется. При нагревании вначале появляется опалесценция, а при дальнейшем нагревании и последующем кипячении выпадает белый хлопьевидный осадок белка. Осадок появляется вследствие того, что в слабокислой среде исследуемые белки находятся в изоэлектрическом состоянии и, денатурируясь при нагревании, легко теряют свою растворимость в результате агрегации. Нейтральный раствор белка в третьей пробирке подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до сильно кислой реакции среды (добавляют 1-3 капли) и нагревают до кипения. Осадок не выпадает, поскольку при избытке водородных ионов (по сравнению с той концентрацией их, которая нужна для достижения изоэлектрического состояния) белки, имевшие в исходном растворе отрицательный заряд, перезаряжаются и приобретают положительный заряд, что придает им устойчивость. К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 2-4 капли 10%раствора едкого натра (до щелочной реакции) и кипятят. Осадка не образуется, так как в щелочной среде подавляется осно́вная диссоциация белка, усиливается кислотная и отрицательный заряд на коллоидных частицах белка возрастает еще более. Рекомендации к составлению протокола Внести в таблицу результаты реакций осаждения белков при нагревании.
Вывод: pH среды оказывает сильное влияние на процесс свертывания белка Дать определение “изоэлектрическая точка” Изоэлектрическая точка, это такое значение кислотности среды, или же промежуток значений, при котором молекула не несет никакого заряда. Обосновать причину образования или отсутствия осадка в различных условиях реакции среды 1)В первом случае опалесценция объясняется укрупнением взвешенных частиц белка. Они удерживаются во взвешенном состоянии, так как эти частицы несут заряд. 2) Осадок появляется вследствие того, что в слабокислой среде исследуемые белки находятся в изоэлектрическом состоянии и, при нагревании, легко теряют свою растворимость в результате агрегации. 3) Осадок не выпадает, поскольку при избытке водородных ионов белки, имевшие в исходном растворе отрицательный заряд, перезаряжаются и приобретают положительный заряд, что придает им устойчивость. 4) Осадка не образуется, так как в щелочной среде подавляется осно́вная диссоциация белка, усиливается кислотная и отрицательный заряд на коллоидных частицах белка возрастает еще более. 1.2. Осаждение белка солями тяжелых металлов. Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде комплексные соединения. Возникновение таких комплексов обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы. Поэтому белки применяют в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов. Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В первую добавляют несколько капель раствора сернокислой меди, а во вторую - несколько капель раствора уксуснокислого свинца. Наблюдают образование осадков. 1.3. Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами. Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами, кроме ортофосфорной, денатурируются и осаждаются из раствора. Выпадение белка в осадок обусловлено дегидратацией белковых молекул и рядом других причин, например, образованием нерастворимых комплексных солей из белка и кислот и др. В избытке серной и соляной кислот происходит растворение первоначально выпавших осадков белка. Избыток азотной кислоты не растворяет осажденный белок, поэтому для обнаружения белка в исследуемом материале пользуются азотной кислотой. Реакция с азотной кислотой является высокоспецифичной и высокочувствительной. Она получила широкое применение при клинических исследованиях мочи на присутствие в ней белка (проба Геллера). Эта реакция лежит в основе количественного определения белка по методу Брандберг-Рабертс-Стольникова. Ход работы. В пробирку наливают приблизительно 1 мл (15—20 капель) концентрированной азотной кислоты и затем, сильно наклонив пробирку (под углом 45°), осторожно приливают по стенке равный объем раствора белка. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка в виде кольца (проба Геллера). Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает. То же проделывают, взяв вместо азотной кислоты концентрированную серную и соляную кислоты. Отличие заключается в том, что образовавшиеся осадки белка в избытке серной и, соответственно, соляной кислоты растворяются. 1.4. Осаждение белка органическими кислотами. Сульфосалициловая и трихлоруксусная кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок. Причем трихлоруксусная кислота, в отличие от сульфосалициловой, осаждает только белки и не осаждает продукты распада белков и аминокислоты. Поэтому эти кислоты часто используются для удаления белков в биологических материалах. Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В первую добавляют несколько капель раствора трихлоруксусной кислоты, а во вторую - несколько капель раствора сульфосалициловой кислоты. Встряхивают пробирки, при этом белок выпадает в осадок. 1.5. Осаждение белка органическими растворителями. Добавление значительных количеств неводных растворителей может влиять на конформацию белковой молекулы. Кроме того, происходит разрушение гидрофобного ядра, так как термодинамически более выгодным становится развернутое (денатурированное) состояние. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Осаждение наступает только из нейтральных или слабо-кислых растворов (в слабокислой среде заряд на коллоидных частицах белка является наименьшим) и более полно в присутствии электролитов, например хлористого натрия, что связано с ослаблением внутримолекулярных ионных связей ввиду конкуренции добавленных анионов и катионов. Если осаждение производить при низкой температуре (от 0 до 15 °С) и полученный осадок быстро отделить от спирта, то белок сохраняет свои природные свойства и может быть вновь растворен в воде. Длительное воздействие спирта приводит к необратимой денатурации белка. Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора белка и прибавляют 2 мл спирта (ацетона). При взбалтывании выпадает осадок белка вследствие дегидратации белковых молекул спиртом (ацетоном). Часть содержимого пробирки переливают в другую пробирку и добавляют воду до растворения осадка. 1.6. Осаждение белка фенолом. Осаждением белков фенолом пользуются для удаления их при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. На способности фенола денатурировать белки основано его дезинфицирующее действие. Ход работы. В пробирку наливают 10 капель раствора белка и добавляют при взбалтывании фенол до появления мути или осадка. Осадок увеличивается при стоянии. Результаты опытов 1.2.-1.6. записать в таблицу. В выводах указать на денатурационные изменения в белках, приводящие к их осаждению.
ВЫВОД по работе Все приведенные осадители по отношению к человеку являются ксенобиотиками. Они являются чужеродными для живых организмов химическими веществамиами, естественно не входящих в биотический круговорот и могут причинить непоправимый вред здоровье при попадании внутрь организма Объясните, к каким последствиям может привести попадание данных ксенобиотиков в организм 1) Отравление тяжёлыми металлами:Ухудшение работы печени, почек; нарушение функционирования ЦНС; заболевание органов дыхательных путей; поражение кожи; заболевание сердечно-сосудистой системы; онкологические заболевания; хронический гастрит или язва; возможен летальный исход. 2) Отравление конц. минеральными кислотами: сильное повреждающее (обжигающее) воздействие на организм. Они способствуют разрушению кожных покровов и слизистых оболочек. В связи с чем образуется сильный отек и болевой синдром (шоковое состояние). 3) Отравление органическими кислотами: Разрушение эритроцитов; Растворение липидов; Поражение почек; Патологические изменения печени. 4) Отравление ацетоном может осложниться пневмонией, острой печеночной и почечной недостаточностью. Тяжелые отравления ацетоном сопровождаются значительным острым расстройством функций внутренних органов, что может привести к полиорганной недостаточности и летальному исходу.Галлюцинации. 5) При попадании фенола на кожные покровы в месте поражения кожа сморщивается и резко бледнеет, затем краснеет, после на этом участке появляются пузыри. После вскрытия пузырей развивается некроз мягких тканей. При обширном поражении кожных покровов помимо местных, возникают и общие симптомы: лихорадка; нарушения дыхания; головная боль; нарушения ритма сердца. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||