Лабораторная работа Бактерии-нефтедеструкторы для биоремедиации супесчаных почв. Лабораторная работа Бактериинефтедеструкторы для биоремедиации супесчаных почв
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Лабораторная работа Бактерии-нефтедеструкторы для биоремедиации супесчаных почв Цель: Целью данной работы является исследование биодеградации углеводородов нефти и разработка микробного консорциума как основы биопрепарата для очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ С неуклонным ростом плотности автотранспорта на территории городов увеличивается число заправочных станций и обслуживающих пунктов, а это, в свою очередь, повышает вероятность возникновения разливов нефтепродуктов и создает пожаро- и экологически опасную ситуацию. В настоящее время эти загрязненные территории не подвергаются обработке. Процесс естественного самовосстановления загрязненной среды является очень длительным: при уровне загрязнения 5 г/кг почвы он длится от 2 до 30 лет и выше. В связи с этим, остро стоит вопрос разработки экологически безопасных и экономически обоснованных мероприятий, направленных на интенсификацию процессов биологической очистки и восстановления плодородия земель. На данный момент существует три способа очистки: механический, физико-химический и биологический. Механическая очистка подразумевает отстаивание и фильтрацию загрязнений, что, во-первых, не решает проблему очистки от растворенных элементов, а, во-вторых, не решает проблему утилизации самих загрязнений, которые остаются практически в неизмененном виде. Пример физического способа очистки — сжигание и термическая десорбция (крекинг). Но при сжигании из-за недостаточно высокой температуры в атмосферу попадают продукты возгонки и неполного окисления нефти. Землю после сжигания необходимо вывозить на свалку (так называемая «горелая земля»). Химическая очистка, хотя и решает проблему очистки от растворенных соединений, опять же не решает проблему утилизации отходов. Биологический ущерб от применения диспергаторов оказался больше, чем ущерб, который можно было ожидать от загрязнения только нефтью, так как эти соединения довольно токсичны. Кроме того, необходимо учесть высокую стоимость самих реактивов и необходимость их точной дозировки. На первое место сейчас выходит биоремедиация (bio — жизнь, remedio — лечение) — очищение природной среды от загрязнений при помощи биологических методов. При этом необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Это может быть биостимуляция аборигенной микрофлоры путем внесения удобрений непосредственно в загрязненную экосистему или внесение специализированных препаратов микроорганизмов, созданных для очистки загрязненных экосистем. Ранее предполагалось, что микроорганизмы, способные разлагать и использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов, встречаются только там, где расположены нефтепромыслы, нефтехранилища или нефтепроводы, однако, согласно современным данным, микроорганизмы-нефтедеструкторы распространены в природе очень широко и могут быть выделены из любой почвы, осадочных пород, морской и речной воды. Эти гетеротрофные микроорганизмы могут усваивать разнообразные органические соединения — углеводы, белки, жиры и пр. Численность микроорганизмов-нефтедеструкторов в естественных биоценозах в немалой степени определяется климатическими условиями, типом почв, степенью их обработки, глубиной залегания грунтовых вод. В большинстве случаев метаболизм парафиновых углеводородов начинается с окисления терминальной метильной группы в спирт и, далее, через альдегид до соответствующей жирной кислоты. Дальше процесс идет по пути β-окисления жирных кислот, при котором за каждый цикл длина цепочки жирной кислоты укорачивается на два углеродных атома. Как правило, ферменты, участвующие в этом процессе, обладают низкой специфичностью и могут участвовать в утилизации углеводородов с различным числом углеродных атомов. Конечные продукты метаболизма нефти в почве следующие: углекислота (связывается в составе карбонатов) и вода; кислородсодержащие соединения (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны), которые частично входят в почвенный гумус, частично растворяются в воде и удаляются из почвенного профиля; Так, главный продукт окисления нафталина — салициловая кислота; антрацена — 3-гидрокси-2-нафтойная; фенантрена — 1-гидрокси-2-нафтойная; хризена — гидроксифенантренкарбоновая и бензо[a]пирена — гидроксипиренкарбоновая кислоты. твердые нерастворимые продукты метаболизма — результат дальнейшего уплотнения высокомолекулярных продуктов или связывания их в органо-минеральные комплексы; твердые корочки высокоминеральных компонентов нефти на поверхности почвы (киры). Именно химический и композиционный состав отдельных компонентов нефти определяют особенности утилизации их микроорганизмами. Решающее значение для использования алифатических углеводородов имеет длина цепи: по мере удлинения цепи парафинов растет число видов микроорганизмов, способных использовать эти соединения, а также активность их использования. После первичной атаки микроорганизмов в нефтезагрязненной среде остаются алканы с очень длинной цепью, полициклические нафтены, полиароматические углеводороды и смеси веществ, составляющие фракцию смол и асфальтенов. Все эти вещества не могут быть метаболизированы отдельными микроорганизмами, и их деструкция в природных условиях связывается с действием смешанных популяций микроорганизмов, — сообществ, для которых характерны отношения кооперации и взаимопомощи.  https://biomolecula.ru/img/content/948/02a.razlivy.png  https://biomolecula.ru/img/content/948/02v.razlivy.png Примеры экосистем с сильным нефтяным загрязнением. В результате биологической обработки нефтяного загрязнения биопрепаратами в окружающей среде остаются легко разлагающийся бактериальный белок, не требующий последующей утилизации, и нетоксичные продукты разложения нефти. Продукты жизнедеятельности бактерий и сами отмирающие бактерии легко усваиваются аборигенной микрофлорой, давая основу для формирования гумуса (при использовании препарата для очистки почвы) или образуя донный ил (в случае применения на воде). Степень очистки зависит от исходной величины загрязнения, вида нефтепродукта, механического состава грунта.  https://biomolecula.ru/img/content/948/03.Acinetobacter.png Морфология штаммов Acinetobacter. После введения в нефтезагрязненную почву некоторых штаммов этих бактерий наблюдается улучшение плодородных свойств почвы. Грамотрицательные бактерии рода Acinetobacter — свободноживущие гетеротрофы, обнаруженные в почве, воде, сточных водах и пище. Некоторые представители Acinetobacter присутствуют в составе кожной микрофлоры человека. Таким образом, представители Acinetobacter распространены практически повсеместно. Их метаболическая универсальность означает, что они могут играть важную роль в коммерчески важных промышленных процессах, а также в биологическом разложении ряда веществ, загрязняющих окружающую среду, — Acinetobacter (в составе микробных сообществ) разлагает соединения, токсичные для большинства микроорганизмов. Некоторые представители рода способны выделять полимеры, которые эмульгируют углеводороды и нефть, делая эти субстраты доступными для разложения в водной среде. Для определения изменения биологической активности почвы в процессе биоремедиации часто используют показатели пероксидазной и полифенолоксидазной активности. Пероксидаза участвует в реакции конденсации веществ при образовании гуминовых кислот, а также в окислительно-восстановительных процессах в почве (ее влияние направлено на окисление гумусовых веществ). Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Увеличение активности пероксидазы объясняется включением фермента в процесс детоксикации, а полифенолоксидазы — трансформацией продуктов нефтяного разложения в компоненты гумуса. Низкие дозы загрязнения активизируют эти ферменты, средние и высокие — оказывают ингибирующее действие. Из литературных данных известно, что внесение в почву структурообразующих субстратов, таких как опилки, торф и т.д., благотворно влияет на биоремедиацию, поскольку такие субстраты, во-первых, служат сорбентами нефтепродуктов, а во-вторых, улучшают аэрацию почвы. Но при этом может возникнуть конкуренция между нефтедеструкторами и целлюлозолитиками за источники азота. Поэтому одним из решений данной проблемы является добавление к консорциуму штаммов диазотрофов, способных к фиксации азота и накоплению его в более доступной форме для нефтедеструкторов. Таким образом, использование консорциума из штаммов Acinetobacter и диазотрофов, таких как Azospirillum, может стать очень перспективным способом очистки нефтяных загрязнений. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы. Acinetobacter, Azospirillum sp.. Среды. В качестве полноценной среды использовали среды ЛурияБертани и Кинга Б, в качестве минеральной – среду Эванса. Культивирование штамма проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл минеральной среды Эванса с добавлением нефти или дизельного топлива до конечной концентрации 2%, 10%, 15%, 20%, 30% или 40% весовых (по объёму). Инокулирование колб проводили суспензией микроорганизмов (посевная доза 1-5×107 кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и выращивали микроорганизмы в течение 7 - 30 суток при 24°С и в течение 10 - 30 суток при 4°С. Определение эффективности очистки нефтезагрязненных систем. 1) Деградацию нефти исследуемым штаммом оцениваем по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия) (Другов и Родин, 2007). 2) Для определения общего содержания углеводородов нефти использовали метод ИК-спектроскопии. Подготовку, анализ и измерение водных и почвенных образцов проводили в соответствии с методическими указаниями «Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометричесим методом» (ГОСТ Р 8.563-96) и «Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии» (МУК 4.1.1956-05). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Деградацию нефти исследованными штаммами оценивали по суммарному показателю её убыли в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия). Штаммы Acinetobacter calcoaceticus и Acinetobacter radioresistens эффективно окисляют ароматические и нециклические компоненты. Особенно важной является способность к росту на ароматических углеводородах, таких как толуол, бензол и ксилол, которые в естественных условиях и при биоремедиации разлагаются сложнее всего. При изучении активности в лаборатории степень деградации нефтепродуктов составила от 40,3 до 99,7% для разных штаммов. В микрополевом опыте в течение 60 дней деструкция нефтепродуктов на участке без добавления биопрепарата составила 8,83% за счет деятельности аборигенной микрофлоры, а на участке с внесением биопрепарата — уже 48,37%.  https://biomolecula.ru/img/content/948/04.dejatelnost-neftedestruktorov.png Деятельность нефтедеструкторов. Слева — опытная колба со штаммами бактерий Acinetobacter. Справа — Контрольная колба без бактерий. Бактерии A. calcoaceticus продуцируют биосурфактант эмульсан, а бактерии A. radioresistans — биосурфактант аласан. Эмульсан эмульгирует легкие фракции нефти, дизельное топливо, сырую нефть и газойли. Аласан — высокомолекулярный комплекс белков и полисахаридов, стабилизирующий различные масляно-водные эмульсии, включающие н-алканы с длиной цепи 10 и более углеродных атомов, алкилароматические углеводороды, жидкий парафин и сырую нефть. Для определения изменения биологической активности почвы в процессе биоремедиации часто используют показатели пероксидазной и полифенолоксидазной активности. Пероксидаза участвует в реакции конденсации веществ при образовании гуминовых кислот, а также в окислительно-восстановительных процессах в почве (ее влияние направлено на окисление гумусовых веществ). Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Увеличение активности пероксидазы объясняется включением фермента в процесс детоксикации, а полифенолоксидазы — трансформацией продуктов нефтяного разложения в компоненты гумуса. Низкие дозы загрязнения активизируют эти ферменты, средние и высокие — оказывают ингибирующее действие.  Динамика окисления нефти в ходе лабораторного опыта. Синие ромбы — контроль (загрязненная нефтью почва + опилки). Красные квадраты — загрязненная нефтью почва + опилки + Acinetobacter. Зеленые треугольники — загрязненная нефтью почва + опилки + Acinetobacter + Azospirillum sp. Методы определения содержания нефти в почве И в конечном |