Тема 2, лекция 2. Лекция 5 общие сведения
 Скачать 236.79 Kb.
|
|
Раздел курса «Нуклеиновые кислоты» Тема 2. Репликация и репарация ДНК Дистанционный курс, лекция 5 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ Репликация и репарация – процессы воспроизведения и исправления повреждений в молекуле ДНК. Для формирования правильного представления о репликации рекомендую посмотреть 6-минутное видео по ссылке: https://www.youtube.com/watch?v=BmAq-EolVCc Для знакомства с принципами репарации – простенькую, но качественную анимацию по ссылке: https://www.youtube.com/watch?v=X7rMnoUb2sQ РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Репликация (от лат. replicatio – возобновление) представляет собой процесс создания двух дочерних молекул ДНК на основе родительской молекулы ДНК. Репликацию ДНК осуществляет сложный комплекс, состоящий из 15-20 различных белков-ферментов, называемый реплисомой. Суть процесса репликации сводится к трем ключевым событиям: 1) сначала с помощью ферментов хеликазы и топоизомеразы двойная спираль материнской ДНК расплетается на две нити; 2) на каждой образовавшейся нити с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая нить, образуя две идентичных дочерних молекулы по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки; 3) в ходе копирования вновь образующиеся молекулы ДНК скручиваются в спираль. Процесс репликации протекает в ядре и обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликационная (репликативная) вилка Репликация проходит в три этапа: а) инициация репликации (начало); б) элонгация (продолжение); в) терминация репликации (окончание). Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться только со строго определённого участка (сайт инициации репликации). Репликон – это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон. Геномы эукариот состоят из большого числа самостоятельных репликонов. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды (маленькие кольцевые молекулы ДНК), которые представляют собой отдельные репликоны. Репликация ДНК – ключевое событие в ходе деления клетки. К моменту деления ДНК должна быть реплицирована полностью и при этом только один раз. Репликация начинается в сайте инициации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка – место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК- полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500-5000 – у эукариот. Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у прокариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами. Основной фермент репликации ДНК у прокариот, осуществляющий синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки при синтезе запаздывающей цепи – ДНК полимераза III. ДНК- полимераза I действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров и дорепликации очищенных мест ДНК. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный. Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле. Ключевые характеристики процесса репликации: а) репликация – матричный процесс. Последовательность синтезируемой цепи ДНК однозначно определяется последовательностью материнской цепи в соответствии с принципом комплементарности; б) репликация – полуконсервативный процесс. Одна цепь молекулы ДНК, образовавшейся в результате репликации, является вновь синтезированной, а вторая – материнской; в) репликация идёт в направлении от 5’-конца новой молекулы к 3’-концу; г) репликация – полунепрерывный процесс. Одна из цепей ДНК синтезируется непрерывно, а вторая – в виде набора отдельных коротких фрагментов (фрагменты Оказаки); д) репликация начинается с определённых участков ДНК (сайты инициации репликации). События репликации в хронологическом порядке у эукариот: 1. ДНК-топоизомеразы, находясь перед репликативной вилкой, разрезают молекулу ДНК для облегчения ее расплетания и раскручивания. 2. ДНК-хеликазы, следуя за топоизомеразами, раскручивают и расплетают молекулу ДНК. 3. ДНК-связывающие белки связывают расплетенные нити ДНК и стабилизируют их, не допуская обратного «слипания» друг с другом. 4. ДНК-полимераза δ (греч. дельта) осуществляет синтез ведущей цепи дочерней ДНК в направлении 5'→3' на матрице материнской нити ДНК по направлению от ее 3'-конца к 5'-концу. 5. Сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется другая ДНК-полимераза α (альфа) и в направлении 5'→3' синтезирует праймер РНК-затравку – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК. Вместо ДНК-полимеразы α (или III) к 3'-концу праймера присоединяется ДНК- полимераза ε. 6. ДНК-полимераза ε (греч. ε – эпсилон) как бы продолжает удлинять праймер, но в качестве субстрата встраивает дезоксирибонуклеотиды (в количестве 150-200 нуклеотидов). В результате образуется цельная нить из двух частей – РНК (т.е. праймер) и ДНК. ДНК-полимераза ε работает до тех пор, пока не встретит праймер предыдущего фрагмента Оказаки (синтезированный чуть ранее). После этого этот фермент удаляется с цепи. 7. ДНК-полимераза β (греч. β – бета) встает вместо ДНК-полимеразы ε, движется в том же направлении (5'→3') и удаляет рибонуклеотиды праймера, одновременно встраивая дезоксирибонуклеотиды на их место. Фермент работает до полного удаления праймера, т.е. пока на его пути не встанет дезоксирибонуклеотид (еще более ранее синтезированный ДНК-полимеразой ε). Связать результат свой работы и впереди стоящую ДНК фермент не в состоянии, поэтому он сходит с цепи. В результате на матрице материнской нити «лежит» фрагмент дочерней ДНК. Он называется фрагмент Оказаки. 8. ДНК-лигаза производит сшивку двух соседних фрагментов Оказаки, т.е. 5'-конца отрезка, синтезированного ДНК-полимеразой ε, и 3'-конца цепи, встроенного ДНК- полимеразой β. Так как на геном любой неделящейся клетки постоянно оказывает влияние окружающая среда, то вполне вероятны повреждения в составе нуклеотида, также возможно встраивание неправильного нуклеотида при репликации. Такие нарушения быстро определяются специальными ферментами, пораженный участок удаляется, заполняется ДНК-полимеразой β и сшивается ДНК-лигазой (возможны также и другие типы повреждений и их исправлений). 9. Вследствие исчерпания матрицы (исходной ДНК) наступает терминация репликации. РЕПАРАЦИЯ ДНК Репарация (от лат. reparatio – восстановление) – особая функция клеток, позволяющая исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённых при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических реагентов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Источники повреждения ДНК: ультрафиолетовое излучение, радиация, химические вещества, ошибки репликации ДНК, апуринизация – отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова, дезаминирование – отщепление аминогруппы от азотистого основания. Основные типы повреждения ДНК: повреждение одиночных нуклеотидов, повреждение пары нуклеотидов, двухцепочечные и одноцепочечные разрывы цепи ДНК, образование поперечных сшивок между основаниями одной цепи или разных цепей ДНК. Каждая из систем репарации включает следующие компоненты: а) ДНК-хеликаза – фермент, «узнающий» химически изменённые участки в цепи и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения; б) ДНКаза (дезоксирибонуклеаза) – фермент, «разрезающий» 1 цепочку ДНК (последовательность нуклеотидов) по фосфодиэфирной связи и удаляющий повреждённый участок: экзонуклеаза работает на концевые нуклеотиды 3` или 5`, эндонуклеаза – на нуклеотиды, отличные от концевых; в) ДНК-полимераза – фермент, синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого; г) ДНК-лигаза – фермент, замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность. У бактерий имеются по крайней мере 3 ферментные системы, ведущие репарацию – прямая, эксцизионная и пострепликативная. У эукариот к ним добавляется ещё Mismatch и SOS-репарация. Типы репарации Существует целый ряд ферментных систем, осуществляющих репарацию. Прямая репарация . Это наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Обычно такая репарация направлена на устранение повреждений, не требующее вырезание цепи. Например, на отщепление модифицирующих групп. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая удаляет метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина. Эксцизионная репарация. От англ. excision – вырезание. Включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы по комплементарной цепи. Ферментативная система удаляет короткую однонитевую последовательность двунитевой ДНК, содержащей ошибочно спаренные или поврежденные основания, и замещает их путём синтеза последовательности, комплементарной оставшейся нити. Эксцизионная репарация является наиболее распространённым способом репарации модифицированных оснований ДНК. Она базируется на распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N- гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований. Другой тип эксцизионной репарации – эксцизионная репарация нуклеотидов, предназначенная для более крупных повреждений, таких как образование пиримидиновых димеров. Пострепликативная репарация. Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей повреждённые участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи специального белка (RecA). Пострепликативная репарация была открыта в клетках E. coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения. Mismatch представляет собой систему обнаружения и репарации вставок, пропусков и ошибочных спариваний нуклеотидов. Суть этого процесса заключается в распознавании дефекта, определении исходной и дочерней нити ДНК, удалении ошибочно включённого нуклеотида и его замена правильным нуклеотидом. Удаляется обычно не только неправильный нуклеотид, но и часть нити ДНК вокруг него, после чего дочерняя нить восстанавливается, используя основную нить как матрицу. SOS-репарация активируется в ответ на повреждения ДНК, вызванные УФ-излучением или действием химических агентов, а также при подавлении репликации и под действием некоторых лекарств. SOS-ответ заключается в усилении работы путей репарации при помощи индукции экспрессии белков, задействованных в эксцизионной репарации или рекомбинационной репарации (например, белка RecA, упоминаемого в пострепликативной репарации). |