|
Биотехнология. Лекция 2 биотехнология (1). Лекция Понятие о генной инженрии, история развития
Биотехнология в животноводстве Лекция - Понятие о генной инженéрии, история развития.
- Основные направления и задачи генной инженерии на современном этапе.
- Получение генов. Химический и ферментативный синтез. Выделение генов с помощью ферментов рестрикции и трансдуцирующих фагов.
- Рестриктазы и их значение.
- Рекомбинантная ДНК. Векторы и их использование для переноса генетического материала.
- Метод электрофорезного анализа ДНК в агаровом геле
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в практике.
- Секвенирование ДНК.
- Генетическая инжéнерия – это конструирование функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) и наследственно измененных организмов.
Датой возникновения генной инженерии считается 1972 год на современном этапе: - получение генноинженерных вакцин;
- получение искусственных белков с заданными свойствами;
- получение гормонов, ферментов;
- диагностика и лечение заболеваний.
Способы получения генов: - выделение генов из ДНК;
- химико-ферментативный синтез;
- ферментативный синтез.
Применение генной инженерии
Сельское хозяйство
Микробиологическая промышленность
Фармакологическая промышленность
Пищевая промышленность
Рестриктазы и их значение. Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) – это ферменты, способные разрезать молекулу ДНК в строго определенных местах с образованием липких концов. Рестриктазы были открыты в 1968 году. Eco часть названия фермента происходит от вида, из которого он был выделен - "E" обозначает общее название, которое является "Escherichia", а "co" обозначает видовое название, "coli", в то время как R представляет конкретный штамм, в данном случае RY13, а I обозначает, что он был первым ферментом, выделенным из этого штамма. -- Г ААТТ Ц -- -- Г ААТТ Ц -- -- Ц ТТАА Г -- Векторы и их использование для переноса генетического материала Вектор – это молекулы ДНК, которые способны переносить чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетке – хозяине. Типы векторов: - 1) векторы для клонирования;
- 2) экспрессионные векторы;
- 3) векторы для трансформации.
Общие свойства вектора: - иметь свойство репликации;
- содержать сайты рестрикции, т.е. участки узнавания для рестриктаз. При этом места разрезания и введения другой ДНК не должны влиять на репликацию вектора;
- иметь один или несколько маркирующих генов, по которым его можно обнаружить;
- содержать специфические для данной клетки промоторы и терминаторы транскрипции.
Методы введения генов в бактериальные клетки: - трансформация (изменение генетического состава клеток путем привнесения извне чужеродного генетического материала, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, и получение таким образом трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками);
- трансфекция (процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот невирусным методом);
- трансдукция (процесс переноса ДНК между клетками при помощи вирусов. Примером трансдукции является перенос бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом.)
Метод электрофорезного анализа ДНК в агаровом геле Принцип метода: - 1) ДНК обрабатывают рестриктазами и помещают в лунки застывшего агарового геля, который затем помещается в камеру для электрофореза.
- 2) под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться в геле, скорость их перемещения зависит от длины фрагмента. Короткие фрагменты движутся быстрее, при этом цепочки ДНК различной длины отделяются друг от друга, но не повреждаются.
- 3) после электрофореза гель окрашивают красителем этидиум бромидом, который связывается с ДНК.
- 4) гель помещают под ультрафиолетовый свет и на нем хорошо видны окрашенные в красный цвет светящиеся фракции ДНК.
В результате электрофорез позволяет разделить, а затем извлечь любые фрагменты ДНК в чистом виде.
Форез
Амплификация
Электрофореграммы
Полимеразная цепная реакция – метод молекулярной биологии. Полимеразно-цепная реакция протекает в 3 стадии: - Денатурация. Смесь, в которой содержится ДНК, нагревают до t 90-95 °С. В течение 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК и образуется 2 одноцепочечных ДНК из одной двухцепочечной.
- Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50 °С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами в течение 30 секунд.
- Полимеризация. Смесь с ДНК нагревают до температуры 70 °С. При этом Tag - полимераза удлиняет оба праймера с их 3`-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Процесс протекает 90 секунд и в результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag -полимераза был выделен из термофильных бактерий и отличается устойчивостью к высоким температурам. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК возрастает в 106 раз. ПЦР- реакция происходит в специальном приборе-амплификаторе.
Секвенирование ДНК Секвенирование — это определение последовательности нуклеотидов в фрагменте ДНК. В результате секвенирования определяется также аминокислотная последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене.
Секвенирование нуклеиновых кислот (другими словами, определение их нуклеотидной последовательности) — это расшифровка первичной структуры линейных молекул ДНК или РНК, состоящих из последовательности «букв» — нуклеозидтрифосфатов: дАТФ (дезоксиадениновая к-та), дГТФ, дЦТФ, дТТФ. и УТФ. Эти «буквы» зачастую именуют просто по азотистому основанию, входящему в их состав — аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), тимин (Т), а также урацил (У) в случае РНК.
«Плюс-минус» метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном. Использование секвенирования по Сэнгеру Секвенирование по Сэнгеру позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар нуклеотидов и применяется для небольших фрагментов генома/генов. В частности, оно используется для: - секвенирования отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов;
- идентификации вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных);
- валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS);
- микросателлитного анализа;
- анализа делеций и инсерций (малых и протяженных).
Капиллярный секвенатор SeqStudio (Applied Biosystems) Запись в словарь - АННОТАЦИЯ ГЕНОМА – маркировка генов и других объектов внутри них.
- ГЕНОМ - наследственный материал, заключенный в клетке организма и необходимый для построения и поддержания его жизнедеятельности. Раздел молекулярной генетики, занимающийся геномом и генами организмов, принято называть геномикой.
- ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы у многих организмов.
- ДНК-БИБЛИОТЕКА (ГЕНОМНАЯ БИБЛИОТЕКА) - набор ДНК-фрагментов всего генома организма. Эти ДНК-фрагменты фланкированы идентичными ДНК-адаптерами и содержат различные вставки генома.
- ДНК-АДАПТЕРЫ - небольшие фрагменты ДНК известной последовательности, фланкирующие ДНК-библиотеку. Используются как участки, с которых начинается амплификация или секвенирование ДНК-библиотеки.
- МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК - своеобразная модификация молекулы ДНК путем присоединении метильной группы (-CH3) к цитозину в составе CpG-динуклеотида. Один из способов регуляции работы генома без изменения нуклеотидной последовательности
- ДНК.НУКЛЕОТИДЫ (НУКЛЕОЗИДФОСФАТЫ) - низкомолекулярные вещества (мономеры), составляющие сложные биологические полимеры: соответственно РНК или ДНК. Нуклеотиды, составляющие ДНК: аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C). В РНК вместо тимина присутствует урацил (U).
- ПЦР (ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ) - молекулярно-биологический метод, позволяющий добиться колоссального (до 1012 раз) увеличения или амплификации числа копий определенного фрагмента ДНК.
- РНК - рибонуклеиновая кислота, макромолекула, образующаяся у многих организмов в результате считывания с ДНК (транскрипции), необходима в процессе синтеза белков, а также многочисленных регуляторных процессов в клетке. Также ответственна за хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы у некоторых вирусов.
- РЕСЕКВЕНИРОВАНИЕ - повторное определение последовательности ДНК организма с уже расшифрованным геномом (применяется, например, при поиске вариантов, связанных с наследственными заболеваниями у человека).
- СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ИЛИ РНК - определение первичной последовательности нуклеотидов в составе макромолекул, несущих наследственную информацию.
- СЕКВЕНИРОВАНИЕ DE NOVO - секвенирование нового для науки (ранее не прочитанного) генома.
- ЧТЕНИЯ (РИДЫ, READS) - фрагменты ДНК (длиной от 25 до 20 000 нуклеотидов), считываемые с генома при помощи специальной машины — секвенатора.
- ЭМУЛЬСИОННАЯ ПЦР (ЭПЦР) - ПЦР, проводимая в эмульсии, где в каждой капельке масла амплифицируется единичная молекула ДНК (фрагмент ДНК).
- ЭПИГЕНОМИКА - один из разделов геномики, посвященный изучению изменения экспрессии генов, вызванного механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК, например, через метилирование ДНК.
Спасибо за внимание! |
|
|
Скачать 2.6 Mb.