Лекция№5Генетика бактерий. Лекция5генетика бактерий
 Скачать 1.65 Mb.
|
|
Л ЕКЦИЯ №5 Г ЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ : МУТАЦИИ И РЕКОМБИНАЦИИ . Г ЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ . Б ИОТЕХНОЛОГИЯ Генетика – наука о наследственности и изменчивости живых организмов. Генетика бактерий – относительно молодая отрасль микробиологии, первые работы по которой появились в начале 1940-х годов. Микробиология Генная инженерия Фармакология Биотехнология О РГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА БАКТЕРИЙ Хромосомные элементы : нуклеоид. Нехромосомные элементы : плазмиды, вставочные последовательности; транспозоны. *Не являются жизненно необходимыми. Нуклеоид – двунитевая молекула ДНК кольцевой формы. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов Плазмиды - внехромосомные мобильные дополнительные генетические структуры бактерий, представляющие собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они могут быть кольцевой формой и линейными. Различают : автономные плазмиды копируются (реплицируются) самостоятельно и существуют в цитоплазме клетки. интегрированные плазмиды – встроенные в хромосому бактерии и реплицирующиеся вместе с ней. Трансмиссивные -(конъюгативные) способны переходить из одной бактерии в другую в процессе конъюгации и Не трансмиссивные плазмиды Нуклеоид Интегрированная плазмида автономная плазмида Плазмиды кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Фенотипические признаки, сообщаемые бактериальной клетке плазмидами. • устойчивость к антибиотикам – R-плазмида ; • продукцию факторов патогенности Ent-плазмида, Hly-плазмида; • образование колицинов Col- плазмида ; способность бактерий к конъюгации и образование F-пилей – F-плазмида • расщепление сложных органических веществ; • образование ферментов рестрикции и модификации. • способность к синтезу антибиотических веществ Мигрирующие (подвижные) элементы Вставочные (инсерционные) последовательности - IS-элементы (от англ. insertion sequences) - это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного места в другое. Транспозоны – сложные перемещающиеся элементы. От IS-элементов они отличаются тем, что кроме генов, ответственных за передвижение, содержат структурные гены, отвечающие за проявление какого-либо фенотипа. Перемещение подвижных генетических элементов по вызывает: • инактивацию генов, регуляцию работы молчащих генов. • образование повреждений генетического материала; • встраивание плазмиды в хромосому; Генотип – совокупность регуляторных и структурных генов бактериальной клетки Фенотип - проявление закодированной в геноме бактерий совокупности морфологических признаков, физиологических функций и других свойств в конкретных условиях существования . Фенотипическая изменчивость- происходит под влиянием внешней среды * адаптивная *не наследуются. Генотипическая изменчивость – стойкое изменение свойств бактерий как результат изменения их генотипа. *долговременная *передается по наследству *возникает вследствие мутаций или генетического обмена. М УТАЦИИ По протяженности повреждений: ● точечные – повреждения одной парой нуклеотидов,, ● протяженные (аберрации): ♦ хромосомные – изменение двух и более участков хромосомы, ♦ генные – изменение гена: *Делеции (выпадение нескольких пар нуклеотидов), * Транспозиции (перемещение группы нуклеотидов в пределах хромосомы), *Инсерция (разрыв путем вставки посторонней ДНК), * Дупликация (добавление нуклеотидных пар) М УТАЦИИ Спонтанные мутации (1 на 10 6 ): Индуцированные мутации Мутагены : физические, химические и биологические. Новый фенотип проявляется только тогда, когда измененный ген начнет функционировать. Генетичекий обмен у бактерий процесс передачи генетического материала у бактерий (внутри вида или между разными видами). Основные пути осуществления : -трансформация -трансдукция -конъюгация Конечным этапом генетического обмена – Рекомбинация - процесс взаимодействия между молекулами ДНК, приводящий к формированию новой рекомбинантной молекулы, несущей признаки от бактерии-донора и от бактерии- реципиента. Трансформация Передача генетического материала между бактериями при помощи свободных фрагментов ДНК. Впервые была воспроизведена Ф.Гриффитсом в 1928 г. Практическая значимость – основной метод генной инженерии Условия, необходимые для успешной трансформации: ДНК донора должна быть выделена из бактериальной культуры того же вида, что и реципиент(или близкородственного) Участок трансформирующей ДНК должен сохранять двунитчатую суперспирализцию Концентрация ДНК должна быть оптимальной Клетки-реципиенты должны быть компетентными, т.е. способными адсорбировать на своей поверхности ДНК донора и поглощать ее Стадии трансформации 1. Адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте 2. Проникновение ДНК внутрь клетки- реципиента 3. Соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией Трансдукция процесс переноса генетического материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту с помощью бактериофага Специфическая - локализованная Неспецифическая – общая Абортивная –несостоявшаяся Биологическая значимость – перенос генов токсигенности Основные этапы Адгезия вирулентного фага на поверхности бактерии-донора с последующим проникновением Размножение бактериофага внутри клетки Самосборка фаговых частиц и образование дефектного бактериофага (сохраняет инфекционные свойства и содержит какой-либо фрагмент ДНК бактерии донора) Перенос дефектным бактериофагом включенной ДНК в клетку-реципиент Рекомбинация и включение перенесенной ДНК в клетку-рециент Неспецифическая трансдукция Неспецифическая трансдукция Основные этапы Интеграция ДНК умеренного бактериофага в определенный участок хромосомы клетки-донора Захват соседних бактериальных генов при выходе из хромосомы Формирование дефектного бактериофага Перенос захваченного фрагмента ДНК донора в клетку-реципиент Включение его в геном клетки-реципиента посредством рекомбинации Специфическая трансдукция Специфическая трансдукция Абортивная трансдукция. ДНК донора не встраивается в хромосому реципиента, а остается в цитоплазме и там самостоятельно функционирует. Передается одной из дочерних клеток и затем теряется в потомстве. К ОНЪЮГАЦИЯ форма обмена генетическим материалом между бактериями при их непосредственном клеточном контакте. Необходимое условие : наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Процесс конъюгации у бактерий впервые был обнаружен Джошуа Ледербергом и Эдвардом Тейтумом в 1946 г. Биологическая значимость – распространение резистентности бактерий к антибиотикам Клетка-донор содержит плазмиду. Типы доноров: • F + -клетки - автономная плазмида (в цитоплазме) • Hfr-клетки – интегрированная плазмида (в бактериальной хромосоме) • F’ –донор - выщепляясь из бактериальной хромосомы, плазмиды могут захватывать часть бактериальных генов и становиться автономными ( F’-плазмида ) Реципиенты : F - клетки( не содержат F- плазмиду ) Донор F+ Реципиент F- F пили мост ик F+ F+ 1. Скрещивание F + x F - :передается только F-плазмида, при этом F - клетка становится F + -клеткой,приобретая плазмиду и свойства донора. Хромосомные гены не передаются. Донор HFR Реципиент F- F пили мост ик HFR F- рекомбинант 2. Скрещивание Hfr x F - : Для проникновения всей хромосомной нити требуется много времени в клетку успевают проникнуть только гены хромосомы донора. Поэтому клетки-реципиенты не становятся донорами Донор F ‘ Реципиент F- F пили мост ик F+ F+ рекомбинант 3. Скрещивание F’ x F - : (есть рекомбинанты) происходит аналогично скрещиванию F + x F - и реципиентная клетка превращается в донорную Генетические основы патогенности Патогенность – потенциальная способность микроорганизма вызывать инфекционный процесс Гены, кодирующие факторы патогенности находятся в хромосоме, плазмидах, транспозонах – «острова патогенности» (крупные участки), «островки патогенности» (мелкие участки) • возможна передача в результате генетического обмена М ОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ Под молекулярно-генетическими методами диагностики инфекционных заболеваний следует понимать методы, позволяющие обнаруживать ДНК или РНК возбудителя в исследуемом материале. К таким методам относятся молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR). П РИМЕНЕНИЕ 1. Диагностика инфекционных заболеваний. 2. Диагностика наследственных заболеваний и предрасположенностей. 3. Установление отцовства. 4. Судебная медицина. 5. Определение уровня экспрессии генов 6. Как один из этапов - в методах чтения последовательностей, генной инженерии и синтетической биологии. П ОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) Метод, позволяющий провести многократное увеличение количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце. Метод обладает крайне высокой чувствительностью (позволяет засечь и размножить единичные молекулы ДНК). Праймеры (олигонуклеотиды) – короткие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплиментарной концам каждой из двух цепей определяемой ДНК.. П РИМЕР ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТА ПЦР K+ 1 2 3 4 5 6 7 K- К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК). 1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные). K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК). ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR, мониторинговая ПЦР, ПЦР-РВ) – это метод, при котором этапы амплификации ДНК мишени и детекция образующихся продуктов происходят одновременно в одной пробирке. количественную оценку содержания ДНК 15 20 25 30 35 40 45 Циклы ПЦР Генетическая( генная) инженерия , - это конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или, иначе, -со С ПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ ! |