Методы изучения генетики человека. Медикогенетическое консультирование
 Скачать 7.09 Mb.
|
|
Лекционный курс по биологии для студентов специальности «Лечебное дело». Профессор кафедры биологии, д.б.н. Корытина Гульназ Фаритовна Тема: Методы изучения генетики человека. Медико-генетическое консультирование. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний. Лекция 2 часть 3 Одним из разделов генетики является генетика человека (антропогенетика), изучающая закономерности наследственности и изменчивости у человека в норме и при патологии. Разделом антропогенетики является медицинская генетика, изучающая закономерности наследственности и изменчивости при патологии у человека, т.е. причины возникновения заболеваний, характер наследования заболеваний в семье, распространение заболевания в популяции. Генетика человека – одна из важнейших основ теоретической медицины. Одним из основоположников медицинской генетики является выдающийся советский невропатологи С.Н. Давиденков (1880-1961). Связанные с биологическими особенностями Невозможно планировать искусственные браки Сложный кариотип - большое число хромосом (2n=46) и генов (около 25 тыс.) Большой генотипический и фенотипический полиморфизм Длительная смена поколений (в среднем 25 лет) Низкая плодовитость из-за небольшого числа потомков (2 – 3 ребенка) Позднее половое созревание (11-13 для девочек, 14-15 лет для мальчиков) Невозможность создания абсолютно одинаковых условий жизни для всего потомства. Связанные с социальной сущностью Невозможность планирования искусственных браков и экспериментирования (гибридологический анализ) Необходимость считаться с особенностями культуры, традициями и обычаями народов. Преимущества человека как объекта генетических исследований: 1.Большое количество особей в популяциях людей. 2. Социальный характер человека. 3.Человек лучше других объектов изучен клинически. 4. Существует большое количество методов, позволяющих компенсировать вышеприведенные трудности. Недостатки человека – объекта генетических исследований Цель медицинской генетики – разработка методов диагностики, лечения и профилактики наследственной (и наследственно обусловленной) патологии человека. Задачи: Определение полной нуклеотидной последовательности ДНК генома человека. (Проект «Геном человека») Описание генетической структуры человеческих популяций Внедрение методов молекулярной биологии в изучение генетики человека Широкое внедрение медико-генетического консультирования Раннее выявление наследственной патологии путем совершенствования методов диагностики Выявление генетически опасных факторов внешней среды и разработка методов их нейтрализации Разработка методов генной терапии наследственных заболеваний на основе генной инженерии. ГеномикаГеномика – наука, изучающая геномы живых организмов Изучает: структуру генома, функционирование генома, эволюционное родство геномов различных организмов Секвенирование ДНК – определение нуклеотидной последовательности (1984 – Нобелевская премия по химии, У. Гилберт, П. Берг, Ф. Сингер) Начало проекта «Геном человека» (1990) 2000 г. – «первая сборка» генома человека 2006 г. – полная расшифровка генома человека (секвенирована первая хромосома – самая большая) Геном человека- двунитевый прерывистый ДНК- геном - содержит 3 млрд. пар оснований, 20-25 тыс.генов - в геноме только 1 %приходится на долю экзонов - вариабельный (индивидуальные отличия в 0,1 % геномов). Обуславливают индивидуальную восприимчивость человека к заболеваниям, разную реакцию на лекарства и факторы окружающей среды. - выявлены гены, мутации которых лежат в основе более 350 заболеваний (некоторых типов рака, болезни Альцгеймера и Паркинсона) Данная информация открывает широкие перспективы в медицине Основные методы исследования генетики человека Генеалогический Близнецовый Биохимический Дерматоглифический Цитогенетический Популяционно-статистический Молекулярно-генетические (методы анализа ДНК) Генетики соматических клеток Математического моделирования Генеалогический метод (Ф. Гальтон, 1883г.) Возможности генеалогического метода: Установить является ли данный признак наследственным Определить тип и характер наследования Выявить гетерозиготное носительство Оценить пенетрантность гена Выявить взаимодействие генов Прогнозировать проявление признака у потомства Этапы генеалогического анализа: 1. Сбор данных обо всех родственниках обследуемого – пробанда. 2. Построение родословной. 3. Анализ родословной. 4. Заключение. При составлении родословной исходным является человек, который обратился в консультацию, для которого изучают родословную – это пробанд. Обычно это больной или носитель определенного признака. При составлении родословной используют условные обозначения, предложенные Юстом в 1931 г моногенное полигенное Аутосомно-доминантный Аутосомно-рецессивный Сцепленный с Х-хромосомой доминантный Сцепленный с Х-хромосомой рецессивный Сцепленный с Y-хромосомой (голандрический) Митохондриальный Типы наследования признаков Аутосомно-доминантный: Признак проявляется в каждом поколении Оба родителя в равной степени передают признак детямребенок у больных родителей Признак имеют в равной степени мужчины и женщины Наследование идет по вертикали и по горизонтали Вероятность наследования 100%, 75% и 50%. синдром Марфана, миотоническая дистрофия, ахондроплазия Аутосомно-рецессивный: Признак проявляется не в каждом поколении; У родителей без признака ребенок с признаком, Признак имеют в равной степени мужчины и женщины; Наследование идет преимущественно по горизонтали; Вероятность наследования 25%, 50% и 100%. муковисцидоз, фенилкетонурия, талассемии, серповидно-клеточная анемия. Врожденный генерализованный гипертрихозСцепленный с Х-хромосомой доминантный: Подобен аутосомно-доминантному типу Мужчина передает этот признак всем дочерям Сыновья получают от отца У-хромосому, поэтому они здоровы Число больных женщин в родословной в 2 раза больше, чем мужчин Гипофосфатемия, коричневая эмаль зубов Сцепленный с Х-хромосомой рецессивный: Признак проявляется не в каждом поколении У родителей без признака ребенок с признаком Признак имеют преимущественно мужчины Наследование идет в основном по горизонтали Вероятность наследования 25% от всех детей и 50% у мальчиков. гемофилия, дальтонизм, наследственная анемия, мышечная дистрофия Сцепленный с Y-половой хромосомой (голандрический): Признак проявляется во всех поколениях; Признак имеют только мужчины; У отца с признаком признак имеют все сыновья; Вероятность наследования у мальчиков 100%. ихтиоза кожи, гипертрихоз наружных слуховых проходов и средних фаланг пальцев, перепонки между пальцами на ногах Митохондриальный тип наследования: Передается от матери всем потомкам и никогда – от отца. Атрофия зрительных нервов Лебера, энцефалопатия Монозиготные (однояйцевые) близнецы – развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют совершенно одинаковый генотип. Дизиготные (двуяйцевые) близнецы – развиваются из нескольких оплодотворенных яйцеклеток и имеют разный генотип. Близнецовый метод (Ф. Гальтон,1876г.) Позволяет оценить роль наследственности и среды в проявлении признаков. Суть метода заключается в сравнении проявления признаков в разных группах близнецов при учете сходства и различия их генотипов Для оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используют формулу Хольцингера: Где Н – доля наследственности; КМБ - конкордантность монозиготных близнецов; КДБ - конкордантность дизиготных близнецов. Е = 100% – Н Влияние среды (Е) на развитие признака вычисляется по формуле: *100%
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫЭлектрофорез белков Хроматография Спектроскопия Жидкостная хроматография Масс-спектроскопия Магнитная резонансная спектроскопия Биохимический метод (начало XX века)Основан на изучении активности ферментных систем. Позволяет выявлять генные мутации – причины болезней обмена веществ (ферментов, аминокислот, гормонов) (например, фенилкетонурия, сахарный диабет). АА Аа Аа Уровень фенилаланина в крови Генотип Быстро падает Медленнее падает Очень медленно снижается Обьекты биохимической диагностики – моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток Программы биохимической диагностики – массовые и селективные Массовые просеивающие программы используются для диагностики ФКУ, АГС, врожденного гипотиреоза, ВПР нервной трубки и болезни Дауна Селективные - для диагностики ФКУ, гемоглобинопатий, нарушений обмена аминокислот и органических кислот Показания для применения биохимических методов диагностикиУ новорожденных - судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах пота и мочи, остановка роста У детей – задержка умственного и физического развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какого-либо НЗ клиническая картина У взрослых – для диагностики НЗ и гетерозиготных состояний (недостаточность альфа1-антитрипсина, Г-6-ФД) Популяционно-статистический методЭто метод изучения генетической структуры популяций Популяция – это совокупность особей одного вида, длительно населяющих одну территорию, относительно изолированных от других групп особей данного вида, свободно скрещивающихся между собой и дающих плодовитое потомство. Позволяет охарактеризовать генофонд популяции. (Генофонд - это совокупность всех аллельных вариантов генов («нормальных» и мутантных), характерных для данной популяции). Позволяет охарактеризовать генетический груз популяции. (Генетический груз – совокупность всех мутантных аллелей и наследственных заболеваний, характерных для данной популяции). Позволяет охарактеризовать генетическую структуру популяции, оценить интенсивность мутационного процесса, роль наследственности и среды в возникновении наследственных болезней. Позволяет охарактеризовать демографические процессы в популяциях человека, выявить источники происхождения мутаций (по градиенту частот), определить основные направления миграций населения по спектру мутаций. Закон Харди-Вайнберга: в идеальной популяции частоты генов и генотипов находятся в равновесии и не изменяются в ряду поколений. 2) (p+q)2 = p2+2pq+q2=1 (100%) 1) p+q=1 (100%) частоты А+а =1 (100%) частоты AA+Aa+aa=1 (100%) Следствия: Мутации изменяют частоту генов в популяции.МУТАЦИИ - внезапные наследуемые изменения генетического материала, вызывающие изменения каких-либо признаков и свойств организма. Классификация мутаций: по уровню организации генетического материала (генные, хромосомные, геномные) по месту возникновения (половые или соматические клетки), по характеру проявления (рецессивные или доминантные), по влиянию на организм (полезные или вредные, в т. ч. летальные, т. е. приводящие к гибели организма), в зависимости от причин (спонтанные или индуцируемые). ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫТермин цитогенетика введен в 1903 г. В.Саттоном. Цитогенетика – область науки, изучающая структуру и функции хромосом Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом Обьектом цитогенетичеких исследований могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫСветовая микроскопия Электронная микроскопия Конфокальная микроскопия Люминесцентная микроскопия Флуоресцентная микроскопия Цитогенетичекие исследования соматических клетокПолучение препаратов митотических хромосом Окраска препаратов (простые, дифференциальные и флуоресцентные) Молекулярно-цитогенетические методы – метод цветной гибридизации in situ (FISH) Спектральное кариотипированиеМногоцветная FISHОснова многоцветной FISH: Использование двух и более специфичных ДНК-проб Анализ относительной пространственной локализации и интенсивностей сигналов SKY MCB Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза) Наличие у ребенка множественных ВПР, не относящихся к генному синдрому Многократные спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с ВПР Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка 6. Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью 7. Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью 8. Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза лечения) 9. Оценка мутагенных воздействий Показания для проведения цитогенетических исследований Денверская классификация хромосом A B C D E F G хромосомы формируют 22 группы с 1 по 22 и + Х и Y хромосомы Парижская классификация хромосом МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫПЦР ПДРФ-анализ Секвенирование Блот-гибридизация по Саузерну Гибридизационные биочипы Полногеномный анализ Метод ПЦР был разработан в 1983 г. Кэрри Мюллисом. В России получил развитие с 1989 г. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК – это метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенный участок ДНК (размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (пн)) в миллиарды раз. Анализ замен нуклеотидов в формате ПЦР в реальном времениЛаминарные боксы для подготовки проб при ПЦР и при работе с РНК и ДНК Приборы и наборы реактивов для проведения исследований профиля экспрессии и полиморфизма генов для определения риска развития заболеваний Амплификаторприбора CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. Наборы RT2 Profiler PCR Arrays (Qiagen) Прибор Quant Studio™12K Flex Real-Time PCR System Позволяет одновременно анализировать 384 целевых гена (анализ экспрессии, уровень метилирования, полиморфизм) или проводить одномоментный анализ 384 образцов и сразу переходить к обработке данных . Чип TaqMan OpenArray Медико-генетическое консультирование – это специализированный вид медицинской помощи с целью профессиональной оценки риска рождения ребенка с наследственной патологией. Необходимость медико-генетического консультирования определяется следующими факторами: Генетический груз населения планеты – 5%: -1% - генные мутации; -0,5% - хромосомные мутации; -3-3,5% - болезни с выраженным наследственным компонентом Наследственными факторами обусловлено: - 40-50% ранней младенческой смертности; - 50% самопроизвольных абортов; - 30% бесплодных браков Каждый человек является носителем в среднем 3-4 -20 мутаций в генах наследственных заболеваний. Добрачное консультирование – до вступления в брак. Проспективное консультирование – при планировании рождения первенца - лучшее время для медико-генетического консультирования. Ретроспективное консультирование – медико-генетическое консультирование семей, где ранее уже отмечалось рождение ребенка с наследственной или врожденной патологией. Консультирование во время беременности – пренатальное. Виды медико-генетического консультирования : Пренатальная диагностика – это диагностика врожденной и наследственной патологии плода на этапе внутриутробного развития. Возраст старше 35 (в России – 39) лет. Наличие не менее двух самопроизвольных абортов на ранних сроках беременности. Наличие в семье ребенка от предыдущей беременности с наследственным заболеванием или врожденным уродством. Наличие моногенных наследственных заболеваний в семье или у кровных родственников. Перенесенные вирусные инфекции (гепатит, краснуха, токсоплазмоз и др.) Применение до зачатия лекарственных препаратов. Облучение кого-нибудь из супругов до зачатия. Основные показания для направления беременной женщины на ПД Прямые -обследуется плод Непрямые - обследуется беременная женщина Методы, применяемые в пренатальной диагностике: неинвазивные инвазивные Прямые неинвазивные методы ПД: ультразвуковая диагностика (УЗИ) УЗИ позволяет выявлять до 80% плодов с анатомическими пороками. На сегодняшний день это самый простой и эффективный метод диагностики анатомических пороков. Биопсия хориона – это получение клеток из будущей плаценты, проводится в 8-12 недель беременности. Риск осложнений (самопроизвольное прерывание беременности) после биопсии хориона составляет 2-3 %. Преимуществами этого метода является срок проведе-ния - до 12 недель и скорость получения ответа - 2-3 дня. Биопсия ворсин хориона Амниоцентез - аспирация амниотической жидкости в 16-24 недели беременности. Кордоцентез - пункция пуповины плода. Оптимальный срок выполнения – 22-25 недель беременности. Процент осложнений не превышает 1%. кордоцентез амниоцентез Благодарю за внимание! |