серологический методы диагностики в микробиологии. серологический метод диагностики. Методы микробиологическойдиагностики. П
 Скачать 1.34 Mb.
|
|
М ЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ . П РИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ . И ММУНОДИАГНОСТИКА РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ . С ЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ И ММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител Широко используются для лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, а также в научно- исследовательской работе. Включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. Ц ЕЛИ И ЗАДАЧИ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА . М ЕХАНИЗМ И ФАЗЫ РЕАКЦИИ « АНТИГЕН - АНТИТЕЛО » В микробиологической практике широкое распространение получили иммунологические методы диагностики Особое место занимают серологические реакции. С ЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД Serum – сыворотка. В этих реакциях участвуют два специфических комплементарных по отношению друг к другу компонента: АГ и соответствующее ему АТ. Они составляют одну систему по типу «ключ-замок» Серологические реакции протекают в 2 фазы Обязательное условие – присутствие электролитов Ф АЗЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ 1 фаза. Специфическая. Происходит взаимодействие АГ-нных детерминантных групп с активными центрами специфических иммуноглобулинов, сформировавшихся под влиянием этого АГ. Последние образуются в ответ на поступление в организм этого АГ. Видимых изменений не происходит. 2 фаза. Неспецифическая. Комплекс АГ+АТ взаимодействует с неспецифическими факторами среды, в которой происходит укрупнение частиц в результате чего реакция становится видимой. Видимые изменения могут быть разными З АДАЧИ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА Поиск неизвестного АГ по известному АТ Поиск неизвестного АТ по известному АГ Широко используется в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний К ЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УЧАСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ И УСЛОВИЙ СРЕДЫ Тип реакции Особенности антигена, его величина Неспецифические компоненты реакции Реакции 1-го порядка – двухкомпонентные: АГ+АТ Агглютинация Гемагглютинация Бактерии Эритроциты Корпускулы, крупные частицы Электролиты (изотонический раствор) Преципитация Нейтрализация Белки, экстракты органов и тканей, лизаты, гаптены, токсины, вирусы Молекулы, растворимые в электролите Электролиты (изотонический раствор) Реакции 2-го порядка – трехкомпонентные: АГ+АТ+Co Реакции иммунного лизиса: бактериолиз, гемолиз, цитолиз Бактерии, эритроциты, другие клетки Клетки Электролиты (изотонический раствор) и комплемент Реакция связывания комплемента (РСК) Гаптены, экстракты, лизаты, полные антигены, клетки Любого размера Электролиты (изотонический раствор) и комплемент 1. Р ЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio – склеивание) – склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов – NaCl Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), “склеенных” антителами. Реакции агглютинации используют для: •определения возбудителя, выделенного от больного; •определения антител в сыворотке крови больного; •определения групп крови Компоненты реакции агглютинации: •АГ – исследуемый (неизвестный) материал, содержащий возбудитель болезни, т.е. сам микроб (при идентификации микробов) или бактериальный диагностикум (при серодиагностике) •АТ – известная агглютинирующая сыворотка (при идентификации микробов) или исследуемая сыворотка, содержащая неизвестные антитела (при серодиагностике) •Физиологический раствор NaCl с pH=7,0-7,4 1.1. О ПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ , ВЫДЕЛЕННОГО ОТ БОЛЬНЫХ Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок. Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного. К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. 1.2. О ПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНОГО Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум. •Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. •Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) – крупнохлопчатая и протекает быстрее. 1.3. Р ЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВ0 с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А(II), В(III). Контролем служат: •сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка AB(IV) группы крови; •антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А(II), B(III). •Отрицательный контроль не содержит антигенов, т.е. используют эритроциты группы 0(I). 2. Р ЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ( ПАССИВНОЙ ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА, РПГА) В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки (монетных столбиков). РНГА ставят на плексигласовых пластинках с лунками (реже в пробирках). Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56С в течение 30 мин., разводят от 1:20 до 1:2000 и более, разливают в лунки по 0,5 мл . К каждому разведению добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в течение 2 часов при 37С. РНГА применяют: 1. Для серодиагностики инфекционных заболеваний, иммунологической идентификации АТ, определения титра иммунных сывороток 2. Для ускорения обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды (возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, дизентерии и др.) Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум - эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин , добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации – РОНГА ). 3. Р ЕАКЦИЯ К УМБСА ( АНТИГЛОБУЛИНОВЫЙ ТЕСТ ) У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. З НАЧЕНИЕ РЕАКЦИИ К УМБСА 1. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери 2. Можно также выявлять неполные антитела против антигенов микробов (например, при бруцеллезе) 4. Р ЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ Преципитация – взаимодействие мелкодисперсных, растворимых антигенов (преципитиногенов) специфическими антителами (преципитинами) в присутствии электролитов с формированием и осаждением комплекса в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах! В качестве антигенов выступают растворимые белки, ЛПС и др. коллоидные растворы, в отличие от РА, где АГ выступает клетка (бактерии, эритроцит и др.) Реакция служит для определения АГ по известной преципитирующей сыворотке, полученной путем иммунизации животных соответствующими АГ. 4.1. Р ЕАКЦИЯ КОЛЬЦЕПРЕЦИПИТАЦИИ Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен). 4.2. Р ЕАКЦИЯ ДВОЙНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ ПО ОУХТЕРЛОНИ Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются. М ЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНОЙ ПАЛОЧКИ Штаммы C.diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина. 4.3. Р ЕАКЦИЯ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. 4.4. Р ЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ ( ПО Р АМОНУ ) -появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин — антитоксин или анатоксин — антитоксин. -Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. 5. Р ЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т.е. их нейтрализацией Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген — антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест- объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген — антитело Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток: А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размножения вирусов; Б - ЦПЭ отсутствует в результате нейтрализации вирусов антителами. 6. Р ЕАКЦИИ ИММУННОГО ЛИЗИСА Реакция иммунного лизиса - растворение жизнеспособных клеток (корпускулярных антигенов), соединенных со специфическими антителами, в присутствии комплемента. В зависимости от участвующих антигенов различают реакции бактериолиза и гемолиза Реакции иммунного лизиса и связывания комплемента протекают при обязательном участии комплемента (дополнительный фактор). Комплемент - сложная система белков сыворотки крови, относится к неспецифическим факторам резистентности, обладающая ферментативной активностью. 6.1. Р ЕАКЦИЯ ИММУННОГО ГЕМОЛИЗА Реакция иммунного гемолиза – растворение эритроцитов в присутствии специфических антител - гемолизинов и комплемента. При образовании комплекса антиген (эритроциты) + антитело (гемолизины) происходит присоединение компонентов комплемента (активация по классическому пути). Сформировавшийся мембранатакующий комплекс (МАК) воздействует на мембрану эритроцитов, через образовавшиеся поры содержимое эритроцитов выходит наружу и происходит гемолиз. Реакция иммунного гемолиза участвует в реакции связывания комплемента в качестве индикаторной системы. 6.2. Р ЕАКЦИЯ ИММУННОГО БАКТЕРИОЛИЗА Реакция бактериолиза – растворение бактерий в присутствии специфических антител – бактериолизинов и комплемента Иммунный лизис бактерий можно наблюдать как в организме животного (in vivo), так и в пробирке (in vitro). Ингредиенты реакции: живые бактерии, специфические по отношению к ним антитела (иммунная сыворотка или иммунизированное животное), комплемент. Как защитная реакция бактериолиз наиболее выражен при холере, сальмонеллезных инфекциях Многие виды бактерий не способны к лизису, поэтому реакция бактериолиза применяется редко. 7. Р ЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс , к которому через Fс-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело. Если же комплекс антиген — антитело не образуется, то комплемент остается свободным. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана). РСК проводят в две фазы: 1. инкубация смеси , содержащей АГ + АТ + Комплемент; 2. индикаторная — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса АГ-АТ происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная) Схема РСК с сывороткой больного Схема РСК с сывороткой здорового С ОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ 8. И ММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА) Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, b-галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител Т ВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА - один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Определение АТ: Определение Аг: ИФА применяют для: 1. диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней 2. определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10 10 — 10 12 г/л. 3. В комплексной оценке иммунного статуса И ММУНОХРОМАТОГРАФИЯ Является разновидностью ИФА И ММУНОБЛОТТИНГ Метод идентификации белков в многокомпонентной смеси. Представляет собой сочетание электрофореза и ИФА (чаще) или РИА 9. Р ЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ, МЕТОДЫ К УНСА ) РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы Аг-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом. Прямой метод РИФ основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом (рис 1). Непрямой метод РИФ - поэтапное выявление комплекса Аг-АТ с помощью флуоресцентных красителей (рис 2): 1 этап: образование иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. 2 этап: выявление этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином. Преимущества РИФ: • простота • высокая чувствительность • скорость получения результата РИФ применяется как метод ранней экспресс- диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др Для проведения РИФ используется люминесцентный микроскоп. П РОТОЧНАЯ ЛАЗЕРНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ Это технология быстрого измерения различных параметров клеток или их органелл Клеточная суспензия, предварительно обработанная флюоресцентными МКАТ или флюоресцентными красителями, подается к потоковому элементу. Клетки идут одна за другой, где в проточной ячейке их пересекает лазерный луч, под действием которого окрашенные клетки флюоресцируют Далее через оптическую систему излучение попадает на регистрирующее устройство, где в дальнейшем обрабатывается. С помощью проточной цитометрии можно определить кол-во популяций и субпопуляций клеток, их размеры и их морфологические характеристики: соотношение ядра и цитоплазмы, степень ассиметрии и др. Также можно выявить стадию дифференцировки и активации клеток, оценить уровень функциональной активности, определять внутриклеточные и секретируемые цитокины; проводить исследования фагоцитоза, анализировать клеточный цикл, оценивать апоптоз и пролиферацию; Можно проанализировать от нескольких десятков до нескольких миллионов клеток |