Методы вывления и идентификации специфических АГ. Методы выявления и идентификации специфических антигенов студентка гр. 8326

• Название: Методы выявления и идентификации специфических антигенов студентка гр. 8326
• Дата: 13.10.2022
• Размер: 6.56 Mb.
• Имя файла: Методы вывления и идентификации специфических АГ.pptx
• Тип: Документы; #731776

Методы выявления и идентификации специфических антигенов

Выполнила: студентка гр. 8326

Петрова Дарья

Вставьте пропущенные словосочетания.

Обязательным условием является сохранение 1)….., которое обеспечивает возможность 2)….. на его поверхности.

Ответ:

• нативной культуры антигена
• связывания антител с неизменными эпитопами

В соответствии с эффектами (склеивание клеток, выпадение в осадок из коллоидного раствора, утратой токсичности и т.д.) различают антитела:

1) Агглютинины (вызывающие агрегацию клеток, несущих АГ)

2) Лизины (вызывающие разрушение клеточных мембран)

3) Преципитины (образующие преципитаты, осадки с растворимыми АГ)

4) Антитоксины (нейтрализующие токсины)

Методы выявления и идентификации специфических АГ включают в себя

ИФА

РИА

Иммунно-флюоресцентный анализ

РНГА

РА

ИЭФ

Реакция преципи-тации

РТГА

1. Иммунофлюоресцентный метод это-

Метод выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного м/о в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс-диагностики.

Прямой

В чем заключается смысл этого метода?

Непрямой

В чем заключается смысл этого метода?

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие АТ образуют комплексы с микробными АГ, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов.(а)

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки-антиглобулиновой, содержащей АТ против кроличьих глобулинов, посколько диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические АТ+ исследуемый АГ) фиксируется флюоресцирующие антиглобулиновые АТ, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии.(б)

Ответ:

2. Иммуноферментный анализ (ИФА) это- Этот метод основан на использовании двух разных по специфичности моноклональных АТ против двух различных АГ эпитопов в составе искомого АГ.

Как проводится этот анализ?

Ответ: в лунки с иммобилизованными АТ против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут АГ. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс АГ-АТ. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом АТ против другого эпитопа того же АГ. После повторной инкубации и отмывания от избытка конъюгата АТ с ферментом определяют количество связавшихся АТ по их ферментативной активности в присутствии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого АГ. На стадии выявления иммунного комплекса АГ оказывается как бы сжатым между молекулами иммобилизированных и меченых АТ(«сэндвич»-метод).

3. Радиоиммунный анализ (РИА) это-

Чрезвычайно чувствительный метод, который может быть использован для количественного определения любого АГ. Чувствительность метода позволяет выявить незначительные количества АГ.

Для количественного определения каких веществ применяют РИА?

Гормонов

(инсулина, гормона роста, АКТГ, трийодтиронинатироксина, эстрогена)

Белков сыворотки крови

(IgE, альфа-фетопротеина и т.д.)

Метаболитов

(фолиевой кислоты, циклических углеводов и др.)

Лекарственных препаратов

(дигоксина, дигитоксина, морфина)

Микробных АГ

(HBsAg)

4. Реакция агглютинации это-

Это иммунная реакция взаимодействия АГ с АТ в присутствии электролитов, причем АГ находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с адсорбированными АГ). Проявляется в виде хлопьев или осадка.

В чем заключается метод агглютинации на стекле?

На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена, капля сыворотки без микробов – контроль антитела, капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.

В чем заключается развернутый метод агглютинации?

Проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов.

5. Реакция непрямой(=пассивной) гемагглютинации(РНГА=РПГА)

Отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале.

Объясните метод по картинке

Ответ:

Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания).

6. Реакция преципитации - это

Формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

Реакции делятся на

Реакция кольцепреципитации

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Реакция радиальной иммунодиффузии.

Иммуноэлектрофорез

Реакция флоккуляции

Ответ: Реакция кольцепреципитации.

В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально. Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.

Ответ: Иммуноэлектрофорез

Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации.

Объясните метод постановки реакции.

Ответ: Реакция флоккуляции

Появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Ставят в 2 этапа. Сначала по стандартной сыворотке устанавливают пороговую величину флоккуляции Lf в 1мл токсина. Lf токсина определяется его минимальным количеством, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 международной единицей(МЕ) сыворотки. Установив силу токсина, приступают к титрованию антитоксической сыворотки. Известный силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в определенном объеме. Пробирки выдерживают в водяной бане при температуре 45°С в течении 30 минут до выпадения хлопьев в одной из них.

Реакция двойной диффузии(=встречной= реакция Оухтерлони)

Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.
Т

1

2

3

4

Чашка Петри с питательной средой

Фильтровальная бумага с антитоксической сывороткой

Заведомо токсигенный штамм(всегда есть линия!)

Бляшка(материал из разных колоний)

Линия преципитации

Ответ: Реакция радиальной иммунодиффузии.

Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.

7. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)- это

Метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.

В чем заключается метод?

Типирование вируса проводят в реакции торможения гемаг-глютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса А с антигенами H0N1, H1N1, Н2N2, H3N2 и др. могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

8. Реакция лизиса. Реакция связывания комплемента(РСК)- это

это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело(первая – специфическая; вторая – индикаторная (гемолитическая))

Сколько компонентов входит в реакцию? Какие?

Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.

Расскажите фазы РСК?

В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента ( РСК ) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.

В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента ( РСК ) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы — эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит.

Расскажите метод постановки РСК

РСК осуществляют в два этапа.

1. Титрование комплемента.

Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента. 2. Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.

Результаты реакции

Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.

При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).

9. Антистрептолизиновая реакция- это

Реакция, основанная на фе­номене нейтрализации гемолитического действия микроб­ного токсина (0-стрептолизина) антитоксическими антитела­ми иммунной сыворотки.

В чем заключается метод этой реакции?

Для постановки реакции предварительно определяют мини­мальную гемолитическую дозу токсина (0-стрептолизина), т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов кролика. Затем определяют рабочую дозу 0-стрептолизина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с 1 АЕ (антитоксической единицы) стандарт­ной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 370С, затем вносят равный объем взвеси эритроцитов и инкубируют 1 час при 370С и 18 часов при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. Положительная реакция характеризуется отсутствием гемолиза в результате нейтрализации стрептолизина (гемолизина) соответствующими антителами.

Спасибо за внимание!