ПЦР-2022 (1). Молекулярные методы
 Скачать 5.57 Mb.
|
|
Методы амплификации нуклеиновых кислот. Фармакопейные требования к проведению ПЦР-анализа Молекулярные методыМолекулярные методы (ММ) позволяют установить на молекулярном уровне качественно и количественно непосредственно патоген (вирус, бактерию, простейшие). ММ основаны на работе с нуклеиновыми кислотами - ДНК и РНК. определяются сверхмалые количества нуклеиновых кислот ДНК или РНК (несколько вирусных геномов). пробы могут быть получены из различных биологических образцов (кровь, моча, мокрота, смывы, соскобы, биопсийный материал), а также из окружающей среды (вода, почва, аэрозоли воздуха); контроля возникновения резистентности к ЛП, контроля эффективности лечения и качества лечебных и профилактических препаратов (живых и инактивированных вакцины); основа персонифицированной (персонализированной) медицины; мониторинга безопасности ЛП в окружающей среде. В фармации молекулярные методы используются для Молекулярные методы анализа - Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) и ее модификации: ПЦР в реальном времени, биочипы, секвенирование. ПЦР – это получение множества копий специфического фрагмента НК в пробирке (in vitro). ПЦР — метод, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе). Амплификация (лат. amplificatio — усиление, увеличение) Развитие метода ПЦР 1980 В России выделена термостабильная ДНК-полимераза (Городецкий) Mullis (США) предложил принцип ПЦР Mullis и Falloona амплифицировали ДНК человека Метод ПЦР стал лабораторным методом 1990 Метод ПЦР стал широко использоваться в клиниках ПЦР- многократное ферментно-опосредованное умножение (амплификацию) заданного участка ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч пар оснований, границы которого соответствуют коротким олигонуклеотидным последовательностям – праймерам, т.е. ПЦР представляет собой циклический синтез in vitro выбранного фрагмента ДНК. Kary Mullis, Нобелевская премия по химии 1993 год Синтез копий молекул ДНК in vivo (полимеразная реакция) происходит во всех организмах во время клеточного деления. Копирование ДНК осуществляют ферменты (ДНК-полимеразы). ПЦР – это получение множества копий специфического фрагмента ДНК в пробирке (in vitro). Молекулярная диагностика основана на поиске и анализе ДНК и РНК. В основе практически всех методов лежит молекулярная гибридизация («отжиг») — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. Что нам понадобится?Нуклеи́новая кислота (от лат. nucleus — ядро) — высокомолекулярное органическое соединение, биополимер (полинуклеотид), образованный остатками нуклеотидов.5- A T G G A A T T C T T T A G A G -3 3- T A C C T T A A G A A A T C T C -5 Проведение ПЦР на матрице ДНКСтадии ПЦР 3-х этапный циклический процесс, в результате которого многократно увеличивается количество специфического фрагмента ДНК1 цикл 0,5-5мин 25-40 циклов I этап цикла ПЦР : денатурацияДенатурация (94 – 95оС) двуцепочечная ДНК «расплавленная» двуцепочечная ДНК 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Во время денатурации под действием высокой температуры (94–95оС) происходит «расплавление» двуцепочечной ДНК, то есть цепи ДНК разделяются, и ДНК переходит в однонитевую форму. Таким образом, освобождается место для «посадки» или гибридизации праймеров. II этап цикла ПЦР : гибридизация (отжиг) праймеровПраймер А отжиг праймеров (50–60оС) «расплавленная» двуцепочечная ДНК 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Праймер В Cпецифические одноцепочечные участки ДНК (праймеры) гибридизуются с комплементарным участком матрицы (исходной, расплавленной ДНК), то есть образуют двунитевую ДНК. Праймеры синтезируются химическим путем и ограничивают исследуемый специфический участок ДНК. Важным фактором, влияющим на эффективность и специфичность амплификации, является подбор оптимальной температуры "отжига" праймеров на матрице. III этап цикла ПЦР : полимеризация или элонгация (720С)Праймер А 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Праймер В ДНК-полимераза ДНК-полимераза 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Праймер В Праймер А dNTPs После этого, фермент, в комплексе с матрицей и праймером, связывает соответствующий следующему нуклеотидному звену матрицы субстрат (дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) и катализирует реакцию его присоединения ДНК-полимераза связывается с участком ДНК, в котором одна из цепей непрерывна (матрица), а другая заканчивается 3’-концом и содержит 3’-гидроксил, необходимый для продолжения цепи (праймер). В процессе ПЦР происходит экспоненциальное накопление фрагмента ДНКколичество циклов число копий Следующий цикл реакции начинается денатурацией полученной ДНК. В этом случае получается в два раза больше молекул, на которых будут гибридизоваться праймеры. Наработка специфического фрагмента подчиняется закону 2n-2n раз, где n – число циклов, а 2n – продут неопределенной длины, полученный в каждом цикле с исходной матрицы ДНК. После проведения 25-30 циклов происходит увеличение фрагмента в 106-108 раз. Амплифиция с обратной транскрипцией (на матрице РНК)РНК Праймер А Реакция обратной транскрипции Полимеразная цепная реакция или ПЦР в реальном времени Мезофильная ревертаза В ходе первой стадии – обратной транскрипции с помощью одного праймера, комплементарного исследуемой РНК, субстратов реакции (dNTPs) и матрицы РНК происходит ферментативный синтез копий ДНК (кДНК) с матрицы РНК. Вторая стадия – это классическая ПЦР. Праймер 2 TTCGAT AAGCTA Двуцепочечная ДНК Праймер 1 ДНК-фрагменты после 1-й амплификации 1 амплификация 2 амплификация (реамплификация) ДНК-фрагмент после 1 ПЦР Денатурация ДНК Элонгация ДНК Отжиг праймеров Денатурация ДНК Праймер 3 Праймер 4 Отжиг праймеров Элонгация ДНК ДНК-фрагменты после 2-й амплификации Схема “гнездовой” (“nested”) ПЦР детекция ДНК в следовых количествах (1-100 копий на пробу) места гибридизации праймеров для второй ПЦР находились внутри участка ДНК, ограниченного праймерами для первой ПЦР. ПЦР с горячим стартом (“Hot start “PCR) применяется для уменьшения неспецифического праймирования в ходе приготовления реакционной смеси при комнатной температуре. Один из компонентов реакции добавляют к реакционной смеси только после нагревания до 950С, либо создают между компонентами механическую преграду (восковую мембрану). После нагревания до 950С мембрана расплавляется, компоненты смешиваются и начинается реакция. Альтернативой является использование модифицированных полимераз или моноклональных антител к ДНК-полимеразе. При этом существенного повышения специфичности не происходит, а выход продукта может быть несколько повышен. ПЦР с плавным снижением температуры отжига (“Touch down” PCR) проводит таким образом, что в первых циклах температура отжига праймеров несколько превышает расчетную, снижая вероятность неспецифического связывания праймеров. Обогащение реакционной смеси специфической матрицей позволяет в последующих циклах снизить температуру отжига на 2-40С и получить значительное количество конечного продукта ПЦР. Градиентный ПЦР (“Gradient” PCR) представляет собой модификацию предыдущей методики, в котором создается линейный градиент температуры отжига с использованием термоциклера. Протяженный ПЦР (“Long”PCR) применяется для амплификации протяженных участков ДНК (более 5000 пар оснований). Обычно используют смесь ДНК-полимераз или ДНК полимеразу с особыми свойствами, в реакционную смесь добавляют дополнительные специфические компоненты. Также существенно увеличивается время элонгации. ПЦР непосредственно в ткани, в клетке (“In situ” PCR) позволяет изучать процессы внутриклеточного размножения и развития вирусов. Выявление продукта обычно проводится методом гибридизации, при этом маркер, связывающий флуоресцентный краситель в ходе анализа, входит в состав праймеров. ПЦР от одной клетки (“Singl-cell” PCR) исследует материал. Полученный от одной клетки методами микроманипуляций. Применяется в экспериментах по генетике человека и животных, в пренатальной диагностике. Метод множественной ПЦРВыделение нуклеиновых кислот Реакция ПЦР (ДНК возбудителя) или ОТ-ПЦР (РНК возбудителя) Учет продуктов амплификации в гель-электрофорезе Праймеры Для ПЦР-1 Праймеры Для ПЦР-2 Возбудитель 1 Возбудитель 2 Метод ПЦР с внутренним контролемВыделение нуклеиновых кислот Реакция ПЦР (ДНК возбудителя) или ОТ-ПЦР (РНК возбудителя) Учет продуктов амплификации в гель-электрофорезе Праймеры Для ПЦР Матрица К+ с местами посадки праймеров Внутренний контроль Возбудитель + - + Детекция продуктов амплификации - электрофорезЭлетрофорез в ПЦРГель-электрофорез — это метод, используемый для разделения фрагментов макромолекул, например, ДНК, РНК или белков в зависимости от их размера и заряда. молекулы ДНК заряжены отрицательно и поэтому двигаются от катода (-) к аноду (+); более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие двигаются быстрее; можно определить абсолютный размер фрагмента ДНК, сравнивая его со стандартным маркером известной длины. Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР. Агарозный гель окрашен бромистым этидием, флуоресцирующим под действием ультрафиолета (здесь с длиной волны 312 нм) Преимущества диагностики на основе ПЦРЧувствительность (несколько копий патогена в пробе 0,2 мл) Специфичность Возможность дифференциальной видовой диагностики Быстрота Возможность определять маскированный возбудитель Возможность диагностики возбудителя в различных образцах ПЦР в реальном времени – диагностика нового поколения Real-time PCRПЦР в реальном времени основана на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. Результат можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Преимущества ПЦР в реальном времени Информацию о составе пробы и о ходе реакции можно получить, не открывая пробирку. Это ускоряет получение результата, снижает опасность контаминации. Наличие специфического зонда, комплиментарного внутреннему участку фрагмента дополнительно проверяет специфичность полученного фрагмента, снижает риск получения ложноположительных результатов. Регистрация интенсивности флюоресценции позволяет судить о количестве в пробе исходной нуклеиновой кислоты. Возможность проводить т.н. множественную ПЦР, т.е. регистрировать в одной реакции несколько ДНК, используя различные флуоресцентные красители. «ПЦР в реальном времени» или Real-Time PCR ДНК или РНК инфекционного агента Real-Time ПЦР ПЦР Флуоресцентный зонд Флуоресцентная метка Использование TagMan зондовTagMan зонд – олигонуклеотид, синтезированный химическим путем, обычно длиннее, чем праймер. TagMan зонд - одноцепочечные ДНК размером 10-17 нуклеотидов, комплиментарных внутреннему участку фрагмента ДНК. К зонду ковалентно пришиты два химических соединения или две молекулы: на 5’ конце находится флуоресцентная метка (т.н. «reporter») или флуорофор, который способен флуоресцировать при облучении; на 3’ конце - гаситель флуоресценции («quencher»). Taq ДНК-полимераза продвигается по одноцепочечной матрице, достигнув зонда, она расщепляет его. При этом расстояние между флуоресцентной меткой и гасителем флуоресценции увеличивается, флуоресценция больше не гасится. I этап цикла ПЦР в реальном времени: денатурацияДенатурация (94 – 95оС) двуцепочечная ДНК «расплавленная» двуцепочечная ДНК 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Во время денатурации под действием высокой температуры (94–95оС) происходит «расплавление» двуцепочечной ДНК, то есть цепи ДНК разделяются, и ДНК переходит в однонитевую форму. Таким образом, освобождается место для «посадки» или гибридизации праймеров. II этап цикла ПЦР в реальном времени: гибридизация (отжиг) праймеров и зондаотжиг праймеров (50–60оС) на 5’ конце находится флуоресцентная метка (т.н. «reporter») или флуорофор, который способен флуоресцировать при облучении; на 3’ конце - гаситель флуоресценции («quencher»). III этап цикла ПЦР в реальном времени: полимеризацияПраймер А 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Праймер В Полимеризация (720С) (620С) ДНК-полимераза ДНК-полимераза 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Праймер В Праймер А dNTPs (pdN)n + P3dN = (pdN)n+1 + Ppi где (pdN)n – растущая цепь ДНК, P3dN – dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфат) (pdN)n+1 –цепь ДНК, удлиненная на один нуклеотид PPi – пирофосфат. Использование флуоресцентных зондов Для создания систем с флуоресцентными зондами использовали следующие критерии: Термостабильные ферменты, в большинстве своём обладают 5’-3’ экзонуклеазной активностью Существуют флуоресцентные красители и химические соединения, которые гасят флуоресценцию Флуоресцентные красителиЧаще всего используются производные флуорисцеина и карбоксиродамина карбоксифлуорисцеин карбоксиродамин FAM, 6-JOE R6G, TAMRA, ROX Dabsyl, Dansyl (амидофосфит) Pyrene (пирены) Анализ данных в реальном времениПо мере увеличения концентрации ампликонов в образце увеличивается и величина Rn Отношение концентрации продукта ПЦР к исходной концентрации матрицы в фазе 1 составляет: Nc = N (1+E)c где Nc – концентрация амплифицированного продукта в каждом цикле ПЦР N – исходная концентрация матрицы Е – эффективность системы С – номер цикла 1 2 3 1 – высокая постоянная эффективность амплификации 2 – эффективность амплификации уменьшается 3 – величина флуоресценции постоянная Результаты ПЦР и ПЦР в реальном времениК+ + + - - - К- ПЦР в реальном времени Обычная ПЦР Термоциклер (амплификатор)Термоциклер (амплификатор) Labcycler производства SensoQuest (Германия) Термоциклер VWR® PCR XT96 Возможность проводить ПЦР на несколько агентов в одной пробиркеВозбудитель 1 Возбудитель 2 Результаты обычной ПЦР Результаты определения ДНК M. bovis и M.tuberculosis методом ПЦР в реальном времени Технология БИОЧИПОВТехнология БИОЧИПОВ В медицине наиболее часто используются белковые и ДНК биочипы. В основе механизма действия биочипов лежит молекулярное распознавание анализируемых молекул молекулами биополимерами, нанесёнными на чип. Это распознавание построено либо на взаимодействии рецепторов с лигандами (например, антител с антигенами), либо на гибридизации комплементарных цепей ДНК. Технология микрочипов (биочипов). ПЦР гибридизация детекция Технология микрочипов (биочипов). ПЦР «Отпечаток пальцев» Человек Струйный принтер Оборудовпание для микроэлектроники Технология микрочипов «Дизайнерский тип» (десятки пятен) Грипп А - 16 подтипов гемагглютинина (H) и 9 подтипов нейраминидазы Dichelobacter nodosus – 9 серогрупп и 19 сероваров Leptospira interrogans – 15 серовариантов Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis - отличие от атипичных штаммов которых H H5
Схема микрочипа для типирования вируса гриппа А 1 микрочип =17 реакциям ПЦР Данный микрочип позволяет типировать вирус гриппа А по 15 подтипам гена HA и 2 подтипам гена NA. Н5 N1 Типирование образцов из Новосибирска Отличие «гриппа, подобного свиному» от эпидемических штаммов человекаГрипп Н1N1 (Калифорния) «подобный свиному» Эпидемический штамм Н1N1 H1 N1 Определение устойчивости M.tuberculosis к рифампицину His 526 >Tyr Технология микрочипов (биочипов) «Тотальный тип» (сотни –тысячи пятен) мРНК – кДНК первой особи (культуры клеток и.т.д.) мРНК – кДНК второй особи Фрагменты индивидуальных генов человека или животного СеквенированиеСеквенирование Секвенирование Новые возможности в диагностике АТГЦАТГЦ ATGC О СН 2 О Р О Р О Р О О О О О О О О Р О Р О Р О OH H А О СН 2 О Р О Р О Р О О О О О О О О Р О Р О Р О H H ATGC Секвенирование «вручную» Развитие секвенирования Автоматическое секвенирование ОФС.1.7.2.0013.15 Полимеразная цепная реакция1.1 Пробоподготовка 1.2 Проведение реакции 1.3 Детекция продуктов амплификации 1.4 Оценка результатов 1.5 Обеспечение качества 1.6 Стандартные и контрольные образцы ГФ XIII Раздел - Методы анализа иммунобиологических лекарственных препаратов Качественное и количественное определение на основе ПЦР применяется при анализе ЛС, получаемых методами рекомбинантной ДНКцитокины, моноклональные антитела, вакцины с использованием рекомбинантных белков (HBsAg, белки вируса папилломы и др.), факторы плазмы крови человека, рецепторы клеток Остаточная ДНК штамма-продуцента определяется методом ПЦР в реальном времени Европейская фармакопея 8.0 Раздел – биологические методыМетоды, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (АНК) Валидация АНК метода обнаружения РНК вируса гепатита С в плазме крови Валидация АНК метода количественного определения вируса В19 в плазме крови Благодарю за внимание! |