ответы бх. Общая схема распада нуклеиновых кислот пищи, ферменты, субстраты
 Скачать 5.47 Mb.
|
|
А. Спонтанные повреждения Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации, дезаминирования нуклеотидов, депуринизации. Ошибки репликации Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 10 5 -10 6 нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включёнными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3'- к 5'- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы. При неправильном спаривании в первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только комплементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях -GATC-. Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её. Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белков mut S, mut L, mut H. Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи . К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3'- к 5'- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвёртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков. Депуринизация (апуринизация) ДНК каждой клетки человека теряет за сутки около 5000 пуриновых остатков вследствие разрыва N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой . Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АП-сайтом (AP-site, или апуриновый сайт). Термин "АП-сайт" используют также в тех случаях, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания и образуются апиримидиновые сайты (от англ, apurinic-apyrimidinic site). Этот тип повреждений устраняет фермент ДНК-инсертаза (от англ, insert - вставлять), который может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв. Дезаминирование Реакции дезаминирования цитозина и превращение его в урацил , аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин происходят значительно реже, чем депуринизация, и составляют 10 реакций на один геном в сутки. Исправление этого вида спонтанного повреждения происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации принимает участие ДНК-N-гликозилаза, гидролизующая связи между аномальным основанием и дезоксирибозой (первый этап), в результате образуется АП-сайт, который распознаёт фермент АП-эндонуклеаза (второй этап). Как только в цепи ДНК возникает разрыв, в работу вступает ещё один фермент - АП-экзонуклеаза, который отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишённую основания (третий этап). В цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза b к З'-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу комплементарности (четвёртый этап). Чтобы соединить два свободных конца (3'-конец встроенного нуклеотида и 5'-конец основной цепи), требуется ещё один фермент - ДНК-лигаза (пятый этап). Нерепарируемо и поэтому опасно дезаминирование метилированного цитозина. Продукт его спонтанного дезаминирования - тимин, Б. Индуцируемые повреждения Индуцируемые повреждения возникают в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы. Образование димеров пиримидиновых оснований Под действием УФО двойная связь между С 5 и С 6 атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований полинуклеотидной цепи, в которых произошёл разрыв., равно примерно 3,4 Это расстояние позволяет освободившимся валентностям между С-С атомами пиримидиновых оснований, расположенных последовательно в цепи ДНК, сформировать циклобутановое кольцо . В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, цитозина или тимин-цитозиновыми димерами. Удаление пиримидиновых димеров происходит под действием фотолиазы Фермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру. В фотолиазе есть участок, либо сам поглощающий фотоны (в синей части спектра), либо связывающийся с кофакторами, адсорбирующими свет. Таким образом, свет активирует фотолиазу, которая распознаёт димеры в облучённой ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами связи. После этого фермент отделяется от ДНК. Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами Азотистые основания в ДНК могут подвергаться разнообразным повреждениям: алкилированию, окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждённому основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы. В. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни Репарация необходима для сохранения нативной структуры генетического материала на протяжении всей жизни организма. Снижение активности ферментов репарационных систем приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК. Причиной многих наследственных болезней человека выступает нарушение отдельных этапов процесса репарации. Пигментная ксеродерма У больных в системе репарации снижена активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, "застройку" бреши и другие функции. Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи. Трихотиодистрофия Заболевание связано с повышенной фоточувствительностью ДНК, вызванной снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная и физическая отсталость; аномалии кожи и зубов. 13. Транскрипция у прокариот. Характеристика компонентов системы синтеза РНК. Структура ДНК-зависимой РНК-полимеразы: роль субъединиц (a 2 ВВ ′ d). Инициация процесса. Определение: оперон - единица транскрипции у прокариот Принцип объединения цистронов в оперон: закодированные в них белки принимают участие в одном типе биохимических реакций. Структура оперона: В начале каждого оперона находится промотор. В конце - терминатор. Перед терминатором располагаются структурные гены, или цистроны. Между промотором и цистронами может находиться оператор. Оператор – особая последовательность нуклеотидов, узнаваемая белком –регулятором. У прокариот существует ТАТААТ- последовательность, она же последовательность Прибнова. Последовательность Прибнова - специфическая нуклеотидная последовательность, обязательная для промоторного участка бактерий, с которой связывается РНК-полимераза. У прокариот синтез РНК осуществляется РНК-полимеразой. РНК-полимераза состоит из нескольких субъединиц. Субъединичный состав РНК-полимеразы Е.coli (2a)bb′w - holo-фермент (полный фермент). Без -фактора это core-фермент (2a)bb′w. Две a субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы. b′ - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот. В b - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте. (сигма) - фактор - сменный фактор специфичности. У core-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов. У сигма фактора низкое сродство к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору. Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом. a. Узнавание и прочное связывание Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в b -субъединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора. 14. Элонгация, терминация транскрипции (ρ-независимая, ρ-зависимая терминация) Элонгация - процесс поэтапного удлинения цепи растущего полимера. Терминация - процесс остановки роста синтезируемой полимерной цепи и отсоединение ее от матрицы. Элонгация - удлинение (последовательное наращивание) цепи РНК (или продолжение транскрипции). Скорость элонгации 40-50 нукл./сек. Субстраты – НТФ (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ), они же источники энергии Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК. Терминация - остановка синтеза РНК, распад тройного комплекса: ДНК, РНК, полимераза Видов терминации несколько (ρ-независимая, ρ-зависимая терминация), механизм терминации зависит от строения участка в конце гена -терминатора. Терминатор - палиндром (участок с комплементарными основаниями) ρ ‒ это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТФ до АДФ и неорганического фосфата). ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, представляющих собой палиндром, и располагаются за 16-20 нуклеотидных пар от точки терминации. Палиндромы (последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево) ρ-независимых терминаторов содержат большое количество Г-Ц-повторов. За этим участком на матричной цепи расположена олиго (А) - последовательность (4-8 адениловых нуклеотидов подряд). Транскрипция в области палиндрома приводит к тому, что в получившемся РНК-транскрипте быстро образуется устойчивый элемент вторичной структуры – «шпилька» – спирализованная область, содержащая комплементарные. ρ-зависимые терминаторы. Одним из факторов транскрипции прокариот является белок ρ. ρ-фактор – это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен связываться с 5-концом синтезируемой РНК длиной около 50 нуклеотидов. ρ-фактор движется по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК. Вследствие того что в терминаторе много Г-Ц-пар (с тремя водородными связями), РНК-полимераза в области терминатора замедляет ход, ρ-фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента, и синтез РНК прекращается. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом 15. Особенности транскрипции у эукариот. Структура белков, регулирующих процесс транскипции. Особенности транскрипции эукариот Единицей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у прокариот. Существуют специализированные ядерные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I - синтезирует пре -рРНК. РНК-полимераза II - синтезирует пре-мРНК. РНК-полимераза III - синтезирует пре-тРНК. РНК-полимеразы различаются количеством субъединиц, их аминокислотным составом, зависимостью от катионов магния и марганца. Кроме ядерных РНК-полимераз у эукариот есть еще РНК-полимеразы митохондрий. Кодируются в ядре. Оператор, как таковой, отсутствует. Промотор есть, но он организован иначе. Промоторные элементы - специфические последовательности нуклеотидов, характерные для любого промотора, связывающего РНК-полимеразу. Первый промоторный элемент - последовательность AТАТАА- (ТАТА-бокс) отделён от сайта начала транскрипции приблизительно на 25 пар нуклеотидов (п.н.). Базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции всеми тремя ядерными РНК-полимеразами. TFIID – основной фактор транскрипции для РНК полимеразы II. Присоединению РНК-полимеразы к промотору, который представлен последовательностью нуклеотидов, богатых Т и А (ТАТА –бокс), предшествует присоединение специального белкового фактора TFIID. Этот фактор состоит из нескольких субъединиц, одна из которых специфически связывается с ТАТАА последовательностью (ТАТА связывающий белок- TBP). !!Вслед за TFIID к промотору начинают присоединяться другие белки и РНК- полимераза. Один из белковых факторов (TFIIH) обладает протеинкиназной активностью и после завершения образования комплекса катализирует фосфорилирование РНК-полимеразы, что и является сигналом для включения транскрипции. Структура белков, регулирующих процесс транскрипции. Две альфа субъединицы - каркас РНК-полимеразы. β - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет содержания большого количества положительно заряженных аминокислот. В β - субъединице находится каталитический центр, отвечающий за связывание между собой рибонуклеотидов σ (сигма) – фактор, который через базальные факторы транскипции связывает РНК –полимеразу с промотором 16. Первичный транскрипт и его процессинг. Рибозимы как пример каталитической активности нуклеиновых кислот. Биороль. Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы. Модификация 5'-конца Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'-фосфатной группой к 5'-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5', 5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N 7 -метилгуанозина завершает формирование кэпа . Модифицированный 5'-конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5'-экзонуклеаз в цитоплазме. Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо для работы сложной ферментной системы, обеспечивающей удаление нитронов. Модификация 3'-конца 3'-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200 остатков адениловой кислоты. Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3'-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает полиА-"хвост", Наличие полиА-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме. Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны. Сплайсинг первичных транскриптов мРНК С появлением методов, позволяющих изучать первичную структуру молекул мРНК в цитоплазме и последовательность нуклеотидов кодирующей её геномной ДНК, было установлено, что они не комплементарны, а длина гена в несколько раз больше "зрелой" мРНК. Последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК, были названы некодирующими, или |