Мультифотонная микроскопия Биология. Севрюгина И.А.142грМультифотонная микроскопия. План работы Мультифотонная микроскопия Преимущества и недостатки мультифотонной микроскопии
 Скачать 15.82 Kb.
|
|
Мультифотонная микроскопия Цель работы: изучить принцип работы мультифотонной микроскопии. План работы: 1.Мультифотонная микроскопия 2.Преимущества и недостатки мультифотонной микроскопии. Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. Преимущества и недостатки мультифотонной микроскопии. 1. Вследствие значительно меньшего поглощения тканей и клеток в ИК- области по сравнению с УФ, уменьшается повреждение живых клеток фотоиндуцированными процессами. 2. По той же причине достигается большая глубина проникновения излучения в биологические объекты. 3. Отсутствие возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального микрообъема, поэтому конфокальная диафрагма не требуется. Формально лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является конфокальным. Недостатком конфокальной микроскопии является поглощение флуорохромом возбуждающего излучения на участках препарата, не участвующими в построении изображения, а именно - лежащих выше или ниже текущего фокуса лазерного луча. Это приводит к ряду нежелательных эффектов: в фокус приходит излучение, ослабленное вышележащими слоями препарата, что ослабляет эффективность возбуждения в фокусе (что особенно важно при исследовании глубоко расположенных слоев препарата); Во внефокусной области происходит фотодеградация красителя и биологических макромолекул, что приводит к преждевременной гибели живых микрообъектов. Ответом на эту проблему было создание лазерных сканирующих микроскопов, осуществляющих возбуждение флуоресценции образца на основе нелинейного оптического эффекта двухфотонного поглощения света |