Производство рибоксина
 Скачать 1.67 Mb.
|
|
Размещено на .ru/ Минобрнауки России федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)» КУРСОВАЯ РАБОТА Тема «Производство рибоксина» Учебная дисциплина Технология биоорганического синтеза Студент С.А.Фрыгин Руководитель А.И.Гинак Санкт-Петербург 2016 Содержание Введение 1. Аналитический обзор 1.1 Характеристика рибоксина 1.2 Способ получения 1.3 Производство препарата 2. Расчетная часть 2.1 Материальный баланс стадии ферментации Заключение Список использованных источников Приложение ферментация рибоксин баланс интоксикация Введение Лекарственный препарат рибоксин является производным пурина. Его можно рассматривать в качестве нуклеозида, то есть вещества, которое в естественных условиях содержится в клетках организма и является предшественником аденозинтрифосфата – АТФ. Оказывает антибиотическое, антиаритмическое, антигипоксическое и коронародилатирующее действие. Участвует в обмене глюкозы, активирует обменные процессы в условиях гипоксии, стимулирует активность ферментов цикла Кребса и синтез нуклеотидов. Активизирует метаболические процессы в миокарде, оказывая положительное действие на обменные процессы в сердечной мышце, увеличивает силу сердечных сокращений, обеспечивает адекватное расслабление мышцы сердца в диастоле. Уменьшает агрегацию тромбоцитов и стимулирует регенерацию ишемизированной ткани. Улучшает кровообращение в коронарных сосудах. Рибоксин абсорбируется в пищеварительном тракте, метаболизируется в печени, почками выделяется в незначительном количестве. Рибоксин применяют при комплексном лечении ИБС (состояние после инфаркта миокарда, стенокардии), нарушении ритма сердца, интоксикации препаратами сердечных гликозидов, лечении кардиомиопатии различного генеза, миокардиодистрофии (на фоне тяжёлых физических нагрузок, инфекционного и эндокринного генеза), миокардите, заболеваниях печени (гепатит, цирроз печени, жировая дистрофия печени), урокопропорфирии; профилактике лейкопении при облучении. Также для улучшения зрительных функций при открытоугольной глаукоме с нормализованным внутриглазным давлением[1]. 1. Аналитический обзор Характеристика рибоксина Международное непатентованное название рибоксина – инозин. Инозин - это вещество, в естественном виде присутствующее в организме. Он участвует во многих процессах, происходящих в организме. Входит в состав нуклеотидов пуриновой группы. Является предшественником создания одного из основных источников энергии – аденозинтрифосфата. Добавление инозина оказывает эффект на ряд процессов, воздействующих на показатели физической деятельности. К ним относятся эффект повышения снабжения мышечной ткани кислородом, что приводит к более эффективной работе мышц и общему повышению качества тренировки. Инозин – это нуклеозид, состоящий из гипоксантина, связанного с ним остатком рибозы посредством β – N9 – гликозидной связи. Графическая формула представлена на рисунке 1. Брутто – формула C10H12N4O5 Молекулярная масса: 268,23 г/моль  Рисунок 1 Графическая формула Ионозин является компонентом тРНК и необходим для транслизме ляции в случае неоднозначных пар оснований. Изучение метаболизма инозина в последние несколько десятков лет привели к открытиям в иммунотерапии. Монофосфат инозина окисляется ферментом инозинмонофосфат дегидрогеназой, образуя монофосфат ксантина, ключевой предшественник в метаболизме пурина[4]. Рибоксин предназначен для приёма внутрь. Принимать препарат необходимо за 30 – 60 минут до приёма пищи. Лечение Рибоксином начинают с приёма 1 таблетки 3 - 4 раза в день. При хорошей переносимости препарата по указанию врача дозировка повышается в 2 раза в течении 2 – 3 дней. Лечение Рибоксином может продолжатся от 4 недель до 3 месяцев. Раствор Рибоксина в ампулах может использоваться внутривенно. Рибоксин обычно переносится хорошо. В отдельных случаях могут отмечаться аллергические реакции: кожный зуд, крапивница, гиперемия кожи. В редких случаях возможно повышение содержания мочевой кислоты в крови. У препарата рибоксин существуют противопоказания: подагра, повышенная чувствительность к препарату, гиперурикемия. Рибоксин при использовании в составе комплексной терапии потенцирует действие антиангинальных, антиаритмических и инотропных препаратов. Случаев передозировки препарата при клиническом применении не зарегистрированно. 1.2 Способ получения Культивирование клеток Bacillus Subtilis продуцента рибоксина производят на среде следующего состава: Глюкоза – 12 г/л БВК – 2,5 г/л NH4NO3 - 2,0 г/л MgCl2 – 0,5 г/л CaCO3 – 2,0 г/л pH среды 6,8 – 7,0 подводится добавлением 40% - ного KOH до автоклавирования. Принятый режим автоклавирования 0,8 атм. А течении 30 мин. При стерилизации автоклавированием все компоненты среды, кроме CaCO3, могут находиться вместе. CaCO3 стерилизуется отдельно. Для подкисления среды используют конц. HCl и конц. H2SO4. В качестве источника углерода продуцент рибоксина Bacillus Subtilis использует в основном глюкозу, очень редко – крахмал. Источниками азота являются амммонийные соли: NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4. Использование нитратного азота купируют рост культуры, в результате чего не идет синтез рибоксина. Наиболее благоприятным соотношением С:N считается соотношение 7:1. Стимулятор образования рибоксина – это добавление естественных источников ростовых факторов (аминокислот, пуриновых соединений) к среде. Снабжение ферментационной среды достаточным количеством кислорода способствует накоплению других метаболитов. Необходимое условие нормального протекания процесса фемрентации – поддержание оптимального значения pH (максимальное накопление рибоксина происходит при рН=5,8-6,2). В результате изучения влияния температурного фактора было определено, что характер биосинтеза – двухфазный: при этом первая фаза характеризуется интенсивным ростом культуры, который завершается к 48 часам ферментации; к началу второй фазы происходит уже более активное накопление рибоксина (оптимальная температура для накопления рибоксина - 31ºС). Температура выращивания посевного материала существенно влияет на развитие культуры [3]. Стадии ферментации рибоксина: Выращивание посевного материала во флаконах; Выращивание посевного материала в ферментаторе; Биосинтез рибоксина в посевном аппарате. 1.3 Производство препарата 1. Получение стерильного сжатого воздуха. Очистка воздуха осуществляется с помощью системы фильтров через которые проходит воздух, на пути следования в ферментатор. В качестве фильтрующего материала используют базальтовое супертонкое волокно. 2. Подготовка индивидуального фильтра. Воздушный фильтр проверяют на герметичность при давлении 1,5-1,7 Мпа, а затем стерилизуют паром 37% раствора формалина в течении 45 минут, затем продувают воздухом в течении 2 часов и нейтрализуют паром в аммиака в течении 45 минут. По окончании стерилизации фильтр сушат потоком сжатого воздуха при давлении 1.4-1.5 Мпа. 3. Выращивание посевного материала. Для засева посевного материала используют партии продуцента, выращенного на поверхности агара во флаконах для биологических работ емкостью 1,5 литра. Используют косяки третьей генерации (срок хранения не более 7 суток). Культуру со сплошного агара смывают стерильным физиологическим раствором (5-7 мл в пробирку). Засев флакона производят суспензией, смытой с одного косяка. Выдерживают 20-30 минут. Выращивание производят в термостате при температуре 37ºС в течении одних суток. Активность культуры 19 г/л. Посевной материал должен быть стерильным. Его можно хранить при температуре 4±2 в течении 10 суток, при этом всхожесть культуры сохраняется не ниже 700 колоний в 1 мл при разведении в 10 раз. Суспензию клеток готовят в боксе. Во флакон наливают 40 мл стерильного физиологического раствора и снимают пленку микробиологической петлей. Полученную суспензию переливают в колбу емкостью 750 мл, содержащую 200 мл физраствора и используют для посева в посевном аппарате через дозатор. 4. Подготовка посевного материала Посевной аппарат вертикальный, цилиндрический, с рубашкой, с коническим днищем имеет: мешалку, барботёр лучевой. Перед загрузкой аппарат моют, проводят внутренний осмотр, проверяют работу барботёра, исправность мешалки и веятелей, крепление гильзы термометра и пробника. Проверяют на герметичность при давлении воздуха 1.3 – 1.6 Мпа мыльным раствором. Если предыдущая стадия была не стерильной, содержимое аппарата стерилизуют в течении часа при температуре 128ºС. Аппарат промывают, заливают в него 0,16 литра 37% раствора формалина и стерилизуют в течении 45 минут при температуре 135ºС и давлении 1.9 – 2,0 кПа, конденсат сливают, формалтн нейтрализуют в аппарате парами аммиака (1 литр) в течении 45 мин. Затем сливают конденсат. Герметичный аппарат стерилизуют в течении 1.0 – 1.5 часов острым паром при температуре 125 - 132ºС. После стерилизации аппарат охлаждается путём подачи на барботёр стерильного сжатого воздуха. По окончании приступают к приёму среды. 5. Засев аппарата и выращивание посевного материала в аппарате. Посев производят через посевной дозатор в зоне спиртового факела суспензией микроорганизмов, смытых с одного флакона. После посева устанавливают режимы: температура 30 ºС, регулируется автоматически; расход воздуха до 1.0 объёма на 1.0 объём среды в минуту; давление 0.4 – 0.5 Мпа; время роста – 16 – 18 часов. Через каждые 8 часов отбирают пробы для контроля за развитием культуры, отсутствием посторонней микрофлоры и контролем pH. Выращенный посевной материал используется для засева ферментатора, если он соответствует следующим показателям: отсутствие посторонней микрофлоры; под микроскопом в окрашенном препарате видны цепочки средней величины базафильных палочек, возможно начало споруляции, причем в поле зрения должно быть не менее 100-200 палочек; рН посевного материала 5,8-6,2. 6. Биосинтез рибоксина в ферментаторе. 6.1. Стерилизация питательной среды. Стерилизацию осуествляют на УНС, состояей из емкости для приготовления питательной среды, насоса, нагревателя-стерилизатора, выдерживателя, холодильника. Питательная среда и насыенный водяной пар непрерывно поступают в нагреватель, где они смешиваются, почти мгновенно достигают температуры 132 ºС. Далее среда поступает в выдерживатель, затем в ТОА-охладитель, где происходит охлаждение среды до температуры, необходимой для ферментации. 6.2. Засев питательной среды и введение процесса биосинтеза в ферментаторе. Засев ферментатора производится из посевного аппарата по заранее простерилизованной посевной линии за счёт разности давлений в посевном аппарате и ферментаторе. Количество посевного материала 12 – 15% засевной среды. Посев происходит при непрерывной подаче воздуха и работающей мешалке. Биосинтез ведут в следующем режиме: температура – 30 ºС, регулируется автоматически; расход воздуха до 1,0 объёма на 1,0 объём среды в мин.; давление 3,0 – 3,5 Мпа непрерывная работа мешалки. В процессе ферментации возможны случаи резкого закисления культуральной жидкости, что ингибирует процесс фотосинтеза. Тогда рН регулируется за счет подачи 25% раствора аммиака и поддерживается в процессе ферментации автоматически. Через 8-12 часов из ферментатора отбираются пробы для определения концентрации рибоксина, редуцирующих веществ, аммонийного азота, рН, микробиологического анализа и проверки на постороннюю микрофлору методом посева в чашки Петри. В случае низкого содержания редуцирующих веществ в питательной среде в первые 15-20 часов ферментации дают покормку в виде 45-50% раствора глюкозы. Раствор глюкозы готовят и стерилизуют в аппарате для приготовления глюкозы. Продолжительность процесса 50-60 часов. Об окончании процесса судят по быстрому возрастанию рН до 6,5. Одновременно ухудшается дыхательная активность продуцента. В момент слива концентрация редуцирующих веществ менее 2%, содержание рибоксина на сливе 22 г/л. Культуральную жидкость подают на стадию коагуляции и фильтрации в коагулятор [2]. 2. Расчетная часть 2.1 Материальный баланс стадии ферментации Уравнение материального баланса в общем виде:  где  - вес стерильной питательной среды, кг; - вес посевного материала, кг, и т.д.Масса стерильной питательной среды:  Масса посевного материала:  Масса пеногасителя:  Масса влаги, унесенной за счет аэрации:  где  – объем уносимого воздуха за счет аэрации с учетом количества содержащегося кислорода, из которого 16% потребляется микроорганизмами, м3; кг/м3 – плотность воздуха; кг/кг сухого вещества – влагосодержание воздуха, выходящего из ферментатора; кг/кг сухого вещества – влагосодержание воздуха, поступающего в ферментатор.  где  – расчет воздуха на ферментацию, м3/с; ч – время ферментации; м3 – объем ферментатора. м3/с м3 Масса брызг:  где  – объем брызг; кг/м3 – плотность брызг.  Рассчитываем количество израсходованного кислорода, выделившегося углекислого газа и воды. Молярная масса глюкоза равна 180,16 г/моль, шести молекул кислорода – 192 г/моль, шести молекул углекислого газа - 276 г/моль, шести молекул воды - 108 г/моль. Вес глюкозы, загружаемой в ферментатор, в пересчете на 100% вещества:   где  - масса вносимой глюкозы с содержанием ее в сырье в количестве 91%.   Количество культуральной жидкости, полученной в результате ферментации:   (5000+750+3+213,4) – ( +300+306,7+120) = 4999,7 кгЗаключение В настоящее время производство рибоксина выросло в связи с расширением применения данного препарата и с его доступностью. Рибоксин принимает участие в обмене глюкозы, улучшает пищеварение, помогает при заболеваниях печени. Но наиболее важный вклад он вносит при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных неинфекционных причин смертности населения. В последние годы профилактические и лечебные мероприятия привели к снижению смертности от ишемической болезни сердца преимущественно среди лиц молодого возраста. И несомненно, большая заслуга в этом принадлежит рибоксину. Список использованных источников 1 Компендиум. Лекарственные препараты. [Электронный ресурс]. / Режим доступа: http://compendium.com.ua/info/95468. Загл. с экрана. Дата обращения: 20.03.2016. 2 Гойтман А.И. Изучение процесса биосинтеза рибоксина в регулируемых условиях с использованием метода материально – энергетического баланса. дисс. На соискание учёной степени к.б.н. Л, 1985. 138 с. 3 Казарионова Л.А., Кострахина М.А. Изучение условий биосинтеза рибоксина мутантами Bacillus Subtillis. М: Микробиологическая промышленность, 1973. 21с. 4 Кнорре.Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Москва: Высшая школа, 2000. 479 с. Приложение  Кривая выхода рибоксина при ферментации (г/л)  Технологическая схема производства рибоксина 1 - смеситель питательной среды; 2 - колонка для непрерывной стерилизации потока питательной среды; 3 - теплообменник - выдерживатель; 4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (или посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки воздуха; 7 - ферментер; 8,9 - насосы; 10 - масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12 - головной фильтр для очистки воздуха
Размещено на .ru | ||||||||||||||||||||||||||