Реакция агглютинации и ее виды (РА)
 Скачать 81 Kb.
|
|
Реферат по микробиологии на тему: «Реакция агглютинации и ее виды (РА)» План: 1. Введение……………………………………………………………………………………..3 2. РА на стекле………………………………………………………………………………….4 3. Пробирочная РА…………………………………………………………………………….5 4. Используемая литература…………………………………………………………………..7 1. Введение. Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие антигена и антител in vitro при определенных условиях сопровождаеют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммунный лизис), что позволяет использовать АГ—АТ-реакции, получившие название серологических (от лат. serum-сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммуные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно использовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни. Реакции агглютинации, например непрямой агглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигеновс антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бактериальные клетки или растворимые антигены, экстрагированные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носителей: эритроцитах, частицах латекса и т.д. Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специфически взаимодействуют с гомологичными антителами (специфическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы антиген—антитело образуют крупные, идимые невооруженным глазом конгломераты, которые выпадают в осадок — агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). У безжгутиковых форм микробов (бруцелл) образуются зернистые агглютинанты, у жгутиковых (эшерихии, салмонеллы) — крупнохлопчатые, которые оседают на дно пробирки в виде перевернутого зонтика и при встряхивании легко разбиваются. Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м растворе хлорида натрия). На течение реакции влияют концентрация соли в электролите, количество микробных клеток во взвеси, крнцентрация сыворотки, рН, температура и другие факторы. Реакция агглютинации (РА). Различают агглютинацию специфическую, в основе к-рой лежит взаимодействие антигена с гомологичным антителом, содержащимся в организме животного, к-рому был введен данный антиген (иммуноагглютинация); неспецифическую (химическую), возникающую от изменения рН среды, концентрации электролитов; спонтанную, к-рую наблюдают при суспендировании бактерий (находящихся в R-форме) в физиологическом растворе и при нагревании, что связано с изменением коллоидного состояния бактериальной клетки. Антиген, участвующий в РА, называется агглютиногеном, антитело — агглютинином, образующийся осадок — агглютинатом. При образовании агглютината имеет значение количественное соотношение антигена и антител (феномен оптимума). При избытке или недостатке антител происходит задержка А. Реакция агглютинации (РА) одна из первых иммунологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые (1895) РА для диагностики брюшного тифа применил Ф. Видаль. Позже (1897) эту же реакцию для диагностики бруцеллеза у людей использовал А. Райт. РА нашла применение также при диагностике пуллороза цыплят, лептоспироза, инфекционного аборта кобыл, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомоизвестной агглютинирующей сыворотке. РА высокочувствительна; с ее помощью можно выявить 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл. Разработано несколько вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исполнению и цели исследования. 2. РА на стекле. При этом варианте РА испытуемыми могут быть как сыворотка, так и антиген, но чаще всего этот вариант используют для идентификации микроорганизмов. 1. Для идентификации микроорганзма (м/о) на обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин. Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке. 2. Обнаружение аниттел в исследуемой сыворотке крови рассмотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серодиагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат. Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание. 3. Пробирочная РА. 1. Обнаружение антител в сыворотке крови рассмотрим на примере РА для серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Схема постановки опыта приведена в таблице 1. Общий объем компонентов реакции 1 мл. Табл. 1. Схема постановки пробирочной РА для обнаружения антител в сыворотке крови.
Из 5-1 пробирки удаляют 0,5 мл жидкости перед добавлением антигена. Одновремено по аналогичной схеме исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки (положительный и отрицательный контроли). Учет результатов начинают с контрольных пробирок — не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й пробирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивнось агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах: 1) (+ + + +) — полная агглютинация — хорошо выраженный осадок и полное просветление жидкости (агглютинировало 100% антигена); 2) (+ + +) — неполная аглютинация с хорошо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена); 3) (+ +) — частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная (агглютинировало 50% антигена); 4) (+) — очень небольшой осадок, жидкость непрозрачная (агглютинировало 25% антигена); 5) (–) — отсутсвие агглютинации, осадка нет, жидкость мутная. За положительный результат принимают агглютинацию минимум на два креста. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови, обеспечивающее агглютинацию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антителв крови исследуемого животного. Табл. 2. Учет результатов РА для обнаружения антител в сыворотке крови
Из приведенного примера (табл. 2) видно, что антиген специфичен, так как отсутствует спонтанная агглютинация с физиологическим раствором и нормальной (отрицательной) сывороткой, и активен — взаимодействует с заведомо положительной сывороткой. Следовательно, можно учитывать результаты РА с исследуемой сывороткой крови. Титр исследуемой сыворотки (титр антител) в данном случае составляет 1 : 200. Пробирочную РА используют не только для серодиагностики инфекционных болезней, но также для оценки активности диагностических агглютинирующих сывороток или интенсивности пост вакционального иммунологического ответа. Количество антител млжет служить диагностическим критерием. Под диагностическим титром понимают минимальное количество антител к данному антигену в исследуемой сыворотке, заведомо превышаеющее количество нормальных антител к используемому в реакции антигену в сыворотке животного того же вида. При диагностическом титре антител и выше животное рассматривают как больное или переболевшее. При некоторых инфекциях этот подход не всегда продуктивен, и тогда исследуют «парные сыворотки», т.е. сыворотки, взятые от животного дважды с интервалом три-четыре недели, причем первую пробу необходимо брать не позднее двух-трех суток после появления клинических симптомов болезни. На активных инфекционный процесс указывает существенное превышение титра антител во второй пробе. 2. Для идентификации м/о используют пробирочную РА, если из-за антигенного родства с различными видами или внутривидовыми сероварами в РА на стекле микроорганизм определить не удалось. Например, если культура E. coli дает в РА на стекле положительный результат одновременно с иммунными сыворотками против нескольких О-серогрупп, ее испытывают как антиген с теми же сыворотками уже в пробирочной РА и относят к той О-серогруппе, с сывороткой которой она дает максимальные титры. Реакция латекс-агглютинации Реакция латекс-агглютинации является одним из видов реакции агглютинации, в которой в качестве носителя антигена или антитела используются синтетические полимерные частицы - латексы. Эта реакция применяется с целью: 1) обнаружения присутствия антител в сыворотке крови обследуемых лиц; 2) идентификации возбудителя заболевания. Для приготовления антигенного латексного диагностикума растворимые мелкодисперсные антигены бактериальной клетки белковой или полисахаридной природы адсорбируют на поверхности окрашенных частиц инертного монодисперсного латекса. Такие нагруженные бактериальным антигеном латексные частицы склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, что приводит к образованию характерного осадка - тонкой пленки с неровными краями ("зонтик"). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Данную реакцию относят к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбированные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки (антительный диагностикум). Антигенные диагностикумы применяют для серологичечкой диагностики, антительные – для обнаружения антигенов в исследуемом материале. РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза – тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации), при положительной реакции выпадает в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопья коричневого осадка. Пробирочная РНГА рекомендована для серологической диагностики многих инфекционных болезней (сальмонеллезы, лептоспироз, трихомоноз и др.). Реакция Кумбса. Данная серологическая реакция также основана на феномене агглютинации. Предназначена для выявления так называемых «неполных» антител, у которых только один активный центр, и по этой причине они могут специфически взаимодействовать с детерминантами антигена, но реакция не завершается формированием макроскопически видимых комплексов антиген-антитело. При наличии неполных (блокирующих) антител на поверхности эритроцитов исследуемого пациента происходит агглютинация эритроцитов при инкубации их с антиглобулиновой сывороткой (прямой тест Кумбса) или с разведениями сыворотки пациента в реакции с предварительно сенсибилизированными эритроцитами донора (непрямой тест). Реакцию Кумбса используют для определения антирезусных тел при внутрисосудистом гемолизе, для диагностики бруцеллеза, некоторых аутоиммунных заболенваний. Используемая литература: 1. Т. С. Костенко, В. Б. Родионова, Д. И. Скородумов. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М.: Колос, 2001. 2. Н. Р.Асонов. Микробиология. М.: Колос, 2001. 3. У. К. Бойд, Основы иммунологии, пер. с англ., М., 1969; 4. В. Д. Тимаков, Микробиология, М., 1973. 5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред.А. А Воробьева. –М.: Медицинское информационное агентство. 2004 г. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||