сан. Санитарная микробиология. Санитарная микробиология
 Скачать 38.06 Kb.
|
|
Санитарная микробиология В биосфере Земли практически отсутствуют среды, лишенные микроорганизмов. Они участвуют в круговороте основных жизненно важных элементов, поддерживают динамическое равновесие биосферы. Санитарная микробиология — наука, изучающая микрофлору окружающей среды и вызываемые её жизнедеятельностью процессы, которые могут непосредственно или косвенно оказывать неблагоприятные влияние на здоровье людей и окружающую среду. Изучение микрофлоры и микробиологических процессов в среде обитания человека необходимо для гигиенической оценки его взаимоотношение с окружающей средой. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием объектов внешней среды. Перед санитарной микробиологией стоят следующие задачи: - Разработка, совершенствование, оценка методов исследования окружающей среды. - Оценка путей воздействия человека и животных на окружающую среду. - Разработка методов микробиологических исследований внешней среды, микробиологических нормативов и мероприятий по оздоровлению объектов внешней среды. На современном этапе задачи санитарной микробиологии осложняются интенсивным загрязнением окружающей среды, влияющим на постоянную, санитарно-показательную и патогенную микрофлору. Человек (больные и носители), теплокровные животные (птицы, млекопитающие) являются основным резервуаром возбудителей большинства инфекционных заболеваний. Многие из которых передаются фекально-оральным и аэрогенным механизмом. Санитарно-микробиологические исследования обязаны решить вопрос о наличии или отсутствии в окружающей среде опасных микроорганизмов. Непосредственное обнаружение возбудителей имеет ряд трудностей. Патогенные микроорганизмы находятся во внешней среде непостоянно (их легче определить в эпидемический период, но труднее — в межэпидемические периоды). Количество патогенных микроорганизмов уступает непатогенным и распространение их в загрязненных объектах неравномерно. Отрицательные результаты определения патогенных микроорганизмов не говорят с достоверностью об их отсутствии. Поэтому к оценке объекта подходят непрямым путем, устанавливая факт загрязнения выделениями человека или животных. И чем обильнее такое загрязнение, тем вероятнее попадание в объект патогенных микроорганизмов. Для многих микробов кишечник или полость рта являются единственной природной средой обитания, поэтому находки таких микроорганизмов свидетельствуют о соответствующем загрязнении выделениями (обнаружение обитателей кишечника говорит о фекальном загрязнении и возможности присутствия шигелл, сальмонелл и пр.). Выделяемые в этих случаях микроорганизмы сушат показателям санитарного неблагополучия поэтому называется санитарно-показательным СПМ санитарно-показательный микроорганизмы Не все микроорганизмов входящие в состав нормальный микрофлоры полости тела человека и животных могут быть санитарно-показательными. Основные требования к санитарно-показательным микроорганизмам должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в больших количествах; не должны иметь другого природного резервуара; после выделения в окружающую среду должны сохранять жизнеспособность течении сроков, близких срокам выживания патогенных микроорганизмов; не должны размножаться в окружающей среде и изменять значительно свои свойства; должны быть достаточно типичными, с тем, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда. Индикация, идентификация и количественный учёт должны производиться современными, простыми, доступными и экономичными методами. все СПМ расцениваются как индикаторы биологического загрязнения. СПМ разделяют условно на три группы между ними нет чёткой границы некоторые являются показателями как фекально такая орального загрязнения или показательными процессов самоочищения. Первая группа включает обитатели кишечника человека и животных индикатор фекального загрязнения в неё входит бгкп, энтерококки, протей, сальмонеллы, клостридии, термофилы, бактериофаги, бактероиды, синегнойная палочка, кандиды, аэромонады, акинетобактерии. 2 группа включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. Индикатор орального загрязнения. В нее входят стрептококки, стафилококки. 3 группа включает сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде. Индикатор процесса самоочищения. В нее входят бактерии-протеолиты. бактерии-аммонификаторы, бактерии-нитрификаторы, некоторые спорообразующие, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии, бделловибрионы, сине-зеленые водоросли. Бактерии группы кишечных палочек К БГКП относятся представители различных родов - Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, но все они выделяются в окружающую среду из кишечника человека и животных. При их характеристике учитывают следующие диагностические признаки грамотрицательные палочки на среди эндо даёт тёмно-красный малиновые колонии с металлическим блеском или без него имеют отрицательный оксидазный тест расщепляют лактозу до кислоты и газа спор не образуют. Бгкп ферментирующие лактозу при 44 указывают на свежие фекальные загрязнение. Энтерококки Постоянно обитают в кишечнике человека и животных. Имеют круглую, овальную или ланцетовидную форму, располагается парами, короткими и длинными цепочками, небольшими скоплениями. Грамположительные аспрогены растут при температуре от +10° до плюс 45°, факультативные анаэробы. На среде с теллуритом калия образуют характерные чёрные колонии. На средах с ТТХ e faecalis образует колония, окрашенные вишнёво-красный цвет, E.faecium -бесцветной колонии, иногда с розовым центром. Энтерококки является показателем свежего фекального загрязнения. Протеи Рассматривают как показатель загрязнения объекта органическими веществами и как показатель фекального загрязнения. Мелкие, полиморфные, грамотрицательные палочки, встречаются нитевидные формы. Подвижны, спор не образуют. Факультативные анаэробы. На средах дают ползучий рост. Присутствие протеев в воде, в пищевых продуктов, смывах всегда свидетельствует о загрязнении объекта разлагающегося субстратами и окраине благополучным санитарном состоянии. Клостридии как правило в не загрязнённых фекалиями и образцах почвы не обнаруживаются. К имеющим янтарно-показательное значение относится к главным образом, C.perfringens C.sporogenes. Это крупные грамположительные, образующие споры, неподвижные, полиморфные палочки. Анаэробы. В среде вильсона-блера образуют чёрные колонии. низкое значение индекса E.Coli и низкое значение C.perfringens указывает на старое фекальное загрязнение. Если оба показателя имеет высокое значение, это свидетельствует о свежем загрязнении. Стафилококки Является индикаторами воздушно-капельного загрязнения. Имеют сферическую форму, располагается в виде гроздей винограда скоплениями, попарно, короткими цепочками. Аспарагенны, неподвижны, грамположительны, факультативные анаэробы при идентификации принято определять их способность коагулировать плазму наличие лецитовителлазы, ферментацию маннита в анаэробных условиях. Для установления источника инфекции путей её распространения проводятся фаготипирование. Как санитарно-показательные микроорганизмы определяются в воздухе в воде плавательных бассейнах зоне рекреации водоёмов пищевых продуктах смывах. Принципы проведения санитарного микробиологических исследований на результаты анализов могут влиять различные факторы при проведении санитарного микробиологических исследований следует соблюдать следующие принципы: правильный забор проб. его проводят соблюдение правил стерильности упаковывать и транспортировать необходимо так чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры исследования необходимо проводить быстро при невозможности материал сохраняется в условиях холодильника не более 6-8 часов. каждая проба сопровождается документом в котором указывается название материала номер пробы время место взятия характеристика объекта подписи лица взявшего пробу. серийность производимых анализов. в объектах внешней среды микроорганизмы распределены равномерно подвергаются взаимному влиянию. для получения адекватных результатов исследуемого объекта. в лаборатории образцы смешиваются тем составляет среднюю пробу. повторность отбора проб Это необходимо для получения сопоставимых результатов. как правило состав микрофлоры в объектах быстро меняется патогенные микроорганизмы поступают в небольшом количестве и распределяются неравномерно. Повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию субстратов. применение стандартных и унифицированных методов исследования утверждённых сопутствующими гостами, санпинами, инструкциями. это даёт возможность различных лабораториях получить сравнимые результаты. использование комплекса тестов. Применяют прямой и косвенные методы позволяющие судить о загрязнении объекта в окружающей среды выделениями человека и животных. при прямом методе обнаруживают патогенных микроорганизмов. при косвенном определяют общую микробную обсеменённость количественный и качественный состав санитарно-показательных микроорганизмов оценка объектов по совокупности полученных результатов оценку результатов проводить с учётом других гигиенических показателей органолептических химических физических и другие методы санитарные микробиологических исследований практическая санитарная микробиология использует два основных метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды. метод прямого обнаружения возбудителя - это наиболее точные надёжные критерии но он обладает низкой чувствительностью метод косвенной индикации возможно присутствие возбудителя во внешней среде при этом определяет общее микробное число и содержание санитарно-показательных микроорганизмов. общая микробное число определяет путём подсчёта всех микроорганизмов в одном грамме или в сантиметре кубическом мл субстрата - это показатель интенсивности загрязнения внешней среды органическими веществами. при определении этого показателя учитывают мезофильные аэробные фактативные анаэробные микроорганизмы выросшие в мясо-пептонном агаре при глубинном посеве. результат выражается количеством колониесобразующих единиц в одном миллилитре сантиметров квадратным или 1 гр исследуемого образца. санитарно-показательный микроорганизма определяют с помощью прямого подсчёта количества бактерий в специальных камерах. метод применяет в экстренных случаях при авариях в системе водоснабжения при необходимости срочного ответа количественном содержании бактерий. метод не позволяет отличить живых от погибших бактерий. в основном используют метод посева на питательные среды. чем больше объект загрязнения выделениями человека и животных тем больше будет спл и вероятнее присутствие патогенов. метод посева на питательные среды позволяют выявить только группа микроорганизмов растущих на определённых средах и при определённой температуре. содержание СПМ выражает в индексах и титрах титры спл наименьший объём исследуемого материала или весовое количество в котором обнаружены хотя бы одна особь СПМ индекс СПМ количество СПМ обнаруженное в определённом объёме или количестве исследованного объекта и индекс величина обратная титру. зная один показатель можно вычислить другой при исследовании пищевых продуктов санитарно показательные микроорганизмы определяют на альтернативной основе то есть указывается масса продукта грамм кубических которые не допускается наличие бактерий. Санитарный микробиологическое исследование воды вода является естественным местом обитания разнообразных микроорганизмов где они находят вещества необходимые для роста и размножения. на качественный состав микрофлоры оказывает влияние различных факторы. в воду могут попадать патогенные микроорганизмы возбудителя дизентерии холеры гепатита А сальмонеллы летоспиры возбудители туляремии и другие. хотя вода не является благоприятной средой для размножения патогенных микроорганизмов они способны определённое время сохраняться в ней. по характеру пользования выделяет питьевую воду централизованного и местного водоснабжения забором из открытых водоёмов или подземных источников воду плавательных бассейнах лёд медицинские хозяйственные и другие. особого внимания санитарные точки зрения требует сточные воды. основаниями для санитарного-микробиологических исследований воды являются: выборы источника централизованного хозяйства на питьевого водоснабжения и контроль за ним контроль эффективности обеззараживание питьевой воды централизованного водоснабжения наблюдение за санитарной эпидемиологические состояния воды открытых водоёмов контроль эффективности обеззараживания воды плавательных бассейнов расследование водных вспышек инфекционных болезней Требования к качеству воды и разных объектов методы исследования и критерии оценки результатов предоставленных в нормативных актах государственных стандартах ГОСТ санитарных правилах и нормах методических указаниях при исследовании воды централизованного водоснабжения руководствуется документами ГОСТ р51232-98 вода питьевая общие требования к организации методам контроля качества мук 4.2.1.018-01 санитарно микробиологический анализ питьевой воды СанПиН 2.1.4.1.074-01 питьевая в атаке гигиенические требования к качеству воды централизованного водоснабжения контроль качества. Общие калиформные бактерии грамотрицательные оксиды отрицательные не образующие спор палочки способные расти на дифференциальных вакцизных средах ферментирующего актосной кислоты альдегиды и газа при температуре 37 + -1° c в течение 24-48 часов термотолерантный калиморфные бактерии входят в число ОКБ обладает всеми их признаками кроме того способны ферментировать лактозы кислоты альдегиды и газы при температуре 44 + -0,5°c в течение 24 часов сульфитредуцирующие клостридии анаэробные палочковидные микроорганизмы редуцирующие сульфат натрия на железо сульфид на макаре при температуре 44 + -1° в течение 16-18 часов колифаги бактериальные вирусы способные лизировать e.coli формировать при температуре 37°c через 18-20 часов зоны лизиса бактериального газона бляшки на питательном агаре. Отбор хранения транспортировка проб Пробу отбирают стерильные ёмкости плотно закрытые пробками силиконовыми резиновыми или из других материалов и защищённые колпачками из плотной бумаги или алюминиевой фольгой. если воду отбирают после обеззараживания химическими реагентами то для нейтрализации в ёмкость до стерилизации вносят натрия серного потокислый и с расчёта 10 мг на 500 мл воды. при исследовании воды из распределительной сети отбор проб и с крана производят после его обжигания и последующего спуска воды не менее 10 минут на полностью открытом кране при отборе проб напор воды уменьшает водой воды набирают столько чтобы пространство между пробкой и поверхностью воды было достаточно пробка не должна смачиваться водой при транспортировке. отобранную пробу маркирует заполняет направление с указанием места даты времени забора цели исследования фамилии специалистов отбиравшего пробы доставляет при температуре 4-10 градусов по Цельсия срок начала исследования от момента отбора проб не должен превышать 6 часов. если пробу нельзя охладить их исследовать в течение 2 часов после забора. если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения анализ проводить нельзя. Определение общего числа микроорганизмов метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов способных на питать на магаре образовывать колоний при температуре 37° в течение 24 часов и видимые с увеличением в 2 раза. из каждой пробы делают посев не менее двух объёмов по 1 мл глубинным методом. пробы в отличие тщательно перемешивается и по 1 мл вносится в 200 стерильные чашки Петри слегка приоткрывая крышки в каждую чашку вливают расплавленные или остужённый питательный агар 45 49° c в количестве 12 мл на чашку диаметром 90-100 мм содержимое быстро перемешивается избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара края и крышки чашки после застывания агара чашки помещают в термостат вверх дном и инкубирует при 37° 24 часа. После термостатирования подсчитывают все выросшие колонии учитывает только те чашки на которых выросла не более 300 изолированных колоний. количество колоний на обеих частях суммируют и делят на два находят среднее арифметическое. результаты выражают числом колонии образующих единицы в одном миллилитре исследуемой воды. если почёт кого они невозможен то в протоколе отмечает сплошной рост. определение ОКБ и ТКБ методом мембранной фильтрации Метод основан на фильтрации установленного объёма воды через мембранные фильмы выращивание посевов на среди эндо и последующим идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. при исследовании питьевой воды анализирует три объёма по 100 мл. воду фильтрует через мембранный фильтры. Фильтры с помощью пломбированного пинцета осторожно переносит на среду эндо не переворачивая фильтр и избегая пузырьков между средой и фильтром. чашки инкубируют при 37° 24 часа. если на фильтрах нет роста или вырос линии характерной колонии выдаёт отрицательный результат ОКБ и ТКБ не обнаружены в 100 мл. если выросли колонии тёмно-красный красный с металлическим блеском или без него с отпечатком на обратной стороне фильтра отсчитывают число кого не каждого типа отдельно ставят тесты для определения ОКБ и ТКБ. для подтверждения ОКБ исследуют не менее 3-4 колоний каждого типа. для подтверждения ТКБ следует все типичные колония но не более 10. каждую колонии следует на оксидазную активность принадлежность к окраске по граму, ферментацию лактозы. для определения оксидазной активности бумажки СИП-оксидаза смачивают дистиллированной водой. часть колонии стеклянной палочкой наносят на подготовленную фильтровальную бумагу штрихом. Реакция считается положительной если в течение 1 минуты появятся синие фиолетово-коричневое окрашивание штриха. при отрицательной реакции цвета штриха не меняется. при положительной реакции эту колонию из дальнейшего исследования исключают. из оксидазоотрицательной колонии делают мазок окрашивают по Граму и микроскопируют. при наличии грамм отрицательных аспорогенных палочек определяют ферментацию лактозы. оставшуюся часть колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой. для подтверждения ОКБ инкубирует при 37°, 48 часов ТКБ 44° 24 часа. первичный учёт возможен через 4-6 часов. при наличии кислоты и газа дают положительный ответ. при отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки для окончательного ответа на ТКБ оставляют до 24 часов на ОКБ до 48 часов. при отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат выписывают не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл и не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл. При подтверждении ОКБ и ТКБ колонии подсчитывают на всех фильтрах и выражает результат анализа в 100 мл воды. вычисление производят по формуле x = a x 100 / v где x - число колоний в 100 мл V - профильтрованный объём воды через фильтр на который велся учёт А - число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме определение ОКБ ТКБ титрационным методом этот метод может быть использован при отсутствии материалов и оборудования необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ в случае преобладания в воде посторонной посторонний микрофлоры препятствующие получению на фильтрах изолированных колоний ОКБ метод основан на накоплении бактерий после посева воды определённых объёмов жидкую питательную среду с последующим пересевом на среду эндо идентификации по культуральным и биохимическим свойствам. при исследовании воды качественным методом текущие надзор производственной контроль засевают 3 объёма по 100 мл. при исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производит посев три объёма по 100 мл три объёма по 10 мл три объёма по 1 мл Каждый объём засевает в ЛПС лактозно-пептонную среду посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной ЛПС, посев 1 мл производит в 10 мл среды обычной концентрации посевы инкубируют при 37° 48 часов. через 24 часа проводит предварительный учёт. из ёмкости где есть рост и образования газа проводят высев из сектора среды эндо для получения изолированных колоний. на одной чашке делается посев не более чем из 3 объёмов. ёмкости без наличия роста и газа оставляют в термостате и просматривают через 48 часов. посевы без признаков роста считают отрицательным и дальнейшим исследованию не подлежат. из ёмкости где отмечен рост делают высев из сектора среды эндо. посевы инкубируют при 37°, 18-20 часов. при наличии роста нас среде и колонии типичных для лактозаположительных бактерий: тёмно-красных или красных с металлическим блеском или без него выпуклые с красным центром или отпечатком на питательной среде дают положительный ответ на присутствие ОКБ в данном объёме. если в среде накопления отмечено только помутнение или принадлежность к лактозоположительным колония вызывается сомнение у исследователей то проводит подтверждающие тест оксидазный окраску по грамма расщепление лактозы до кислоты и газа. Отрицательный ответ даёт если: в среде накопления нет признаков роста на секторе и среды эндо нет роста на среди эндо выросли не характерные для калиморфных бактерий колонии все колонии оказались оксидазоложительными все колония оказались грамположительными если на среде с лактозой не отмечено газообразования. при исследовании 3 объёмов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объёмов делается запись обнаружены в 100 мл при исследовании количественным методом определяют наиболее верное число ОКБ и ТКБ по таблице отрицательном ответы наличие ОКБ во всех исследованных объёмах в этой заключении не обнаружено 100 мл определение спор сульфитредуцирующих клостридий метод основан на выращивание посева в железа сульфид на агаре в условиях приближённых к анаэробных и при подсчёте сват чёрных колоний Пробу воды 20 мл прогревает на водяной бане в пробирках при температуре 75 + -5° c 15 минут для исключения вегетативных форм. при исследовании хлорированной воды подогревании пробы можно не производить. определение проводят методом фильтрования в пробирках методом фильтрования в чашках и методом прямого посева. при определении прямым посевом стерильные пробирки вносят по 10 мл в 2 стерильные пробирки или по 5 мл в 4 стерильные пробирки посева засевают горчим железо-сульфитным агаром в количестве превышающем объём воды в два раза. среду заливает по стенке пробирки избегая образования пузырьков воздуха. после этого пробирки быстро охлаждают. посевы инкубируют при 44°с 16-18 часов. учитывают те посевы где получены черные изолированные колонии. результаты анализа выражают числом КОЕ спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды. при отсутствии роста чёрных колоний дают ответ не обнаружено в 20 мл воды. определение колифагов определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения культуре E.Coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона E.Coli на питательном агаре. Определение колифагов проводят прямым методом, качественным и количественным. |