глубинная ферментация лимонной кислоты. Глубинная ферментация лимонной кислоты - StudentLib.com. Соонсн2соон
Скачать 380.5 Kb.
|
ВВЕДЕНИЕ Лимонная кислота является основным подкислителем. Ее доля составляет около 75% объема всех производимых подкис лит елей. Особенно широко она используется в производстве безалкогольных напитков, которым придает фруктовые и ягодные запахи и вкус. Расширяется сфера применения лимонной кислоты в технических целях — в химической, текстильной, кожевенной, металлургической и других отраслях промышленности. Спрос на лимонную кислоту непрерывно растет, но в бывших социалистических странах он удовлетворяется крайне слабо, поэтому в настоящее время организуются новые производственные мощности по выпуску этого ценного продукта. Лимонную кислоту производят главным образом путем микробного синтеза, который является важной отраслью биотехнологии. Настоящий отчет посвящен микроорганизмам—продуцентам лимонной кислоты и современным достижениям биотехнологии в области биосинтеза органических кислот. Описаны теоретические основы микробного синтеза и механизмы регуляции метаболизма органических кислот, их связь с общей физиологией микробных клеток. В работе отражен многолетний опыт авторов в промышленном биосинтезе органических кислот. Описываются способы утилизации отходов производства лимонной кислоты с целью получения ценных кормовых продуктов. Лимонная кислота НООС-СН2С(ОН) -СООН-СН2-СООН является моноокситрикарбоновой кислотой, кристаллизующейся из водных растворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в виде бесцветных прозрачных ромбообразных кристаллов .Моногидратная лимонная кислота имеет молекулярную массу 210, плотность 1,540 г/см3 и температуру плавления 70—75 СС. Кристаллизационная вода теряется при хранении и интенсивно выделяется при температурах, превышающих 40—50 °С. При 100 °С вода теряется полностью. При температуре кристаллизации 36,6 °С и выше выделяется безводная лимонная кислота с молекулярной массой 192 и температурой плавления 153 °С. При нагревании до 175 °С лимонная кислота разлагается. Лимонная кислота хорошо растворяется в воде (1460 г/л при 20 °С) и умеренно — в этаноле (620 г/л при 25 °С). СН2СООН | НО—С—СООН I СНзСООН Соли лимонной кислоты — цитраты — имеют низкую водораство-римость. Лимонная кислота широко распространена в природе. Особенно много ее в незрелых фруктах и ягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и др.), где лимонная кислота является естественным консервирующим агентом. Продуценты лимонной кислоты После первых публикаций К.Вемера о способностях микромицетов синтезировать органические кислоты, в том числе лимонную, многие микробиологи стали тщательно изучать физиологию грибов и их биосинтетические способности. Многочисленные проверки показали явно выраженный потенциал сверхсинтеза лимонной кислоты у целого ряда микромицетов, дрожжевых грибов и бактерий. В зависимости от химической природы окисляемого субстрата (свекловичная, тростниковая, цитрусовая или финиковая меласса, сок сахарного тростника, гидрол, гидролизаты крахмала, багасса, сахароза, глюкоза, парафины и много других субстратов) в качестве продуцентов лимонной кислоты в более или менее широких масштабах используют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus, Penicillium, Trichodermaи Botrytis, дрожжевые грибы родов Candida, Delaromycesи Torulopsis, а также бактерии родов Arthrobacterium, Pseudomonasи Micrococcus. Детально изучены многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillusawamori, A.aureus, A.clavatus, A.glaucus, A.niger. Самым широко распространенным продуцентом лимонной кислоты является микромицет Aspergillusniger, физиология и механизм биосинтеза лимонной кислоты которого наиболее изучены. В настоящее время для биосинтеза лимонной кислоты в качестве основного сырья широко используют мелассу — отходы сахароперерабатывающей промышленности. В зависимости от исходного материала различают свекловичную, тростниковую, цитрусовую и другие виды мелассы. На международном рынке ежегодна продается 30—35 млн. т этого сырья. В России ежегодный объем производства мелассы составляет 3 млн. т. Хотя меласса в основном используется для кормовых целей, ее широко применяют также в микробиологической промышленности. Свекловичная меласса характеризуется высоким содержанием 'Сахаров (46—55%), из которых преобладает сахароза. Меласса имеет сложный и непостоянный химический состав. Она содержит коллоиды, органические кислоты, витамины, белки и свободные .аминокислоты, сложный спектр минеральных веществ (табл. 4.8— 4.10). Из нелетучих органических кислот в мелассе могут присутствовать, %: лимонная — 0,01—0,5; глюконовая — 0,5—1,0; яблочная — 0,1—0,5; янтарная — 0,1—0,7. Хорошо сбраживаемая меласса должна содержать не более 1% инвертного сахара и не более 1% СаО и 0,06,% сернистого газа (добавляемого в мелассу в качестве консервирующего агента) при общем содержании сухих веществ не менее 75% и Сахаров не менее 46,% при невысоком содержании живых микроорганизмов. В золе свекловичной мелассы много калия, магния, железа, но относительно мало фосфора. Химический состав мелассы зависит от климатических и почвенных условий выращивания сахарной свеклы, применяемых минеральных удобрений, времени уборки урожая (поздние сроки уборки отрицательно влияют на качество мелассы), технологических нюансов переработки сахарной свеклы, условий транспортировки и хранения мелассы. Производство мелассы связано с сезонными доставками сырья. В производстве лимонной кислоты наилучшие результаты дает зрелая, выдержанная меласса. Важное значение имеют длительность хранения мелассы и наличие герметически закрытых емкостей — мелассохранилищ с пневматическим перемешиванием (для предотвращения расслоения), насосами, устройствами для подачи и забора мелассы из разных горизонтальных хранилищ. В последнее десятилетие качество мелассы ухудшается под влиянием ряда дополнительных факторов, связанных с техническим прогрессом . Широко применяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты и минеральные удобрения могут оставлять определенные отрицательные следы в сельскохозяйственной продукции, в частности в мелассе, где обнаружены инсектициды, например фосфорорганический инсектицид малатилон (до 90 мг в 1 кг мелассы), оказывающий ингибирующее влияние на биосинтез лимонной кислоты . В мелассе установлено присутствие некоторых фунгицидов (трилон, мертрилан и др.). Данные о влиянии фунгицидов на биосинтез лимонной кислоты неоднозначны. Некоторые авторы утверждают, что ряд фунгицидов подавляет активность ферментов изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы и тем самым способствует биосинтезу лимонной кислоты, во всяком случае у дикорастующих культур Aspergillusniger. По данным других авторов, фунгициды отрицательно влияют на ацидогенез. Обнаружено угнетение синтеза белка в клетках Aspergillusnigerпод действием ртутьорганического фунгицида мертрилана. В результате его воздействия на ферменты ЦТК (в частности на малат-, изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы) резко понижаются интенсивность дыхания клеток и активность терминальных оксидо-редуктаз, особенно цитохромоксидазы. Фунгицид трилан (4,5,6-трихлорбензоксазолидон) также отрицательно влияет на метаболизм микромицета Aspergillusniger, по механизм его воздействия другой . Все исследованные фунгициды подавляют интенсивность дыхания, тормозят синтез белка, нарушают проницаемость цитоплазматических мембран . В мелассе нередко обнаруживается присутствие детергентов.Их влияние на микроорганизмы изучено слабо. Установлено изменение проницаемости клеточной мембраны Aspergillusnigerи как следствие — повышенная гидроксилазная активность культуры. Способ культивирования Успехи глубинной ферментации в производстве антибиотиков побудили производителей лимонной кислоты искать пути глубинного культивирования ее продуцентов. В СССР первой глубинное культивирование продуцентов лимонной кислоты освоила группа исследователей под руководством Г. И. Журавского в 50-е гг., применяя синтетические сахарозные среды и специально селекционированный для глубинного культивирования штамм Aspergillusniger{. В качестве сырья для глубинной ферментации лимонной кислоты может быть использован широкий набор природных субстратов: меласса, глюкоза, сахароза, жидкие парафины и другие источники углерода . Технология глубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой явно выраженный двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращивание посевного материала из конидиоспор в посевной среде (на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации (0,8—1,0 объема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном перемешивании среды. Продолжительность культивирования на стадии выращивания посевного материала — 2 сут (1 сут — на качалке, 1 — на посевном аппарате). Сказанное принципиально не исключает непосредственного применения конидиоспор в качестве посевного материала для ос- новной ферментации, однако это существенно удлиняет цикл ферментации: с 7—8 до 12—13 сут . Основную ферментацию в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 и количестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. Начальная концентрация Сахаров — 10— 14%, часто применяют подкормку свежей средой, особенно в случаях применения мелассных сред . Регуляции рН среды не требуется, но поскольку лимонная кислота очень коррозионна и для ферментационного оборудования необходима устойчивая к коррозии сталь, то для смягчения коррозионное практикуют подщелачивание ферментируемого субстрата до рН 3,8—4,2. Процесс ферментации имеет черты двух фаз, или стадий: формирования биомассы и кислотообразования. Для фазы роста биомассы характерно объединение молодого мицелия в шарообразные агломераты, формирование которых продолжается до 70—80 ч ферментации. Некоторая часть гиф остается в свободном виде. Во время интенсивного роста потребность продуцента в молекулярном кислороде составляет до 1 кг па каждый кубометр ферментируемого субстрата в час. В фазе биосинтеза лимонной кислоты потребность в кислороде в некоторой степени снижается и составляет 0,5—0,6 кг 02/м3-ч. Для обеспечения массопередачи кислорода в ферментируемый субстрат вводится стерильный воздух в количестве 0,8—1,0 объема на 1 объем среды в минуту, одновременно с помощью мешалки создается циркуляция среды со скоростью, соответствующей 1,2—1,5 м/с вдоль стенки ферментатора. Насыщение среды кислородом в начальной фазе ферментации должно составлять 20—25,% от полного насыщения, в фазе биосинтеза лимонной кислоты — 10—15,%. Для обеспечения массооб-меиа молекулярного кислорода необходим расход электроэнергии в количестве 1,8—2,2 кВт на 1 м3 среды. Температурные режимы в ферментируемом субстрате дифференцированы: в фазе роста биомассы — 32—33 °С, в фазе кислотообразования — 30—31 °С. В зависимости от особенностей используемого мутанта Aspergillusnigerприменяют разные варианты технологических режимов глубинной технологии. 1. ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЕЧНОЙ ПРОДУКЦИИ ПРОЕКТИРУЕМОГО ПРОИЗВОДСТВА 1.Техническое наименование продукта – лимонная кислота (чистота 99,9%). 2. Лимонная кислота будет выпускаться в соответствии с требованиями ГОСТ 908—79. 3.Лимонную кислоту получают из культуральной жидкости при глубинном культивировании микроскопического гриба Aspergillus niger с последующим отделением биомассы.
Лимонная кислота по качеству должна соответствовать показателям, предусмотренным ГОСТ 908—79 . Это должны быть бесцветные кристаллы или белый порошок, без "комков, для кислоты I сорта допускается желтоватый оттенок, вкус кислый, без постороннего привкуса, 2%-ный раствор кислоты в дистиллированной воде должен не иметь запаха, быть прозрачным и не содержать механических примесей, структура —сыпучая, сухая, наощупь не липкая, без посторонних примесей. За рубежом лимонную кислоту классифицируют по величине кристаллов на ситовых аппаратах. Большое внимание обращают на легкообугливающиеся вещества, дающие окраску при нагревании в течение определенного времени с концентрированной серной кислотой при температуре 90 °С. Они вызываются следами органических соединений — сахара, оксиметилфурфурола, других альдегидов и спиртов, за исключением цис- и трансаконитовой, изолимонной, щавелевой, янтарной и олеиновой кислот, эритрита, ксилита и сорбита [93]. Для удаления легкообугливающихся веществ предложено много способов: выделение цитрата кальция в присутствии 10 % пероксида водорода к количеству лимонной кислоты; нагревание до кипения растворов лимонной кислоты после отделения гипса в сочетании с обработкой пероксидом водорода; добавление к раствору лимонной кислоты перед кристаллизацией борной кислоты в количестве 0,1—0,3 % по массе раствора, экстракция фреоном и др. ^Наиболее эффективным способом очистки кристаллов лимонной кислоты от'всех примесей является перекристаллизация. Лимонная кислота сорта экстра по всем показателям и нормам соответствует данным Британской фармакопеи 1968 г. Лимонная кислота выпускается только в упакованном виде: реализуемая через розничную сеть —в мелкой фасовке массой нетто 10—100 г; предназначенная для предприятий пищевой и других отраслей промышленности — в крупной фасовке массой нетто 10—40 кг. При фасовке допускаются отклонения по массе нетто, не превышающие при массе до 50 г ±4 %, от 50 до ПО г +3 %. При упаковке кислоты в ящики и мешки допускаются отклонения, не превышающие ±0,5 %. Мелкая фасовка должна проводиться в пакеты из «пищевой» нестабилизи-рованной полиэтиленовой пленки марки Н, толщиной не менее 0,08 мм; из эти-кетировочной бумаги односторонней гладкости, ламинированной с внутренней стороны полиэтиленом высокого давления или пачки из бумаги марки Е по ГОСТ 7247—73 с внутренним вкладышем из подпергамента марки П-3. Пакеты и пачки оформляют красочными рисунками и надписями (товарный знак или «аименование предприятия-изготовителя и его подчиненность, наименование продукции и ее сорта, дата выработки, масса нетто, цена, обозначение настоящего стандарта). Пакеты и пачки с кислотой должны упаковываться в ящики из гофрированного картона № 13 массой нетто не более 10 кг. Крупная фасовка проводится в льно-джуто-кенафные тканевые мешки или льняные продуктовые массой нетто не более 40 кг, в ящики из гофрированного картона. Внутрь мешков или ящиков должны вставляться мешки-вкладыши из полиэтиленовой пленки, которые после заполнения кислотой герметически закрывают путем сварки. Допускается завязка увязочным шпагатом из лубяных волокон. Верхние швы тканевых наружных мешков зашивают машинным способом льняными нитками или вручную — увязочным шпагатом из лубяных волокон. При внутригородских перевозках допускается упаковка кислоты в бумажные непропитанные открытые трехслойные мешки с внутренним мешком-вкладышем из полиэтиленовой пленки массой нетто не более 25 кг; в ящики из гофрированного картона, выстланные подпергаментом марки П-3, полностью покрывающим всю внутреннюю поверхность тары. Транспортную тару маркируют с нанесением манипуляционного знака «Боится сырости». На ряде заводов крупная фасовка лимонной кислоты механизирована: установлены полуавтоматические весы, зашивочные машины и транспортное оборудование. Фирма American Association of Cereal Chemist Inc. выпускает лимонную кислоту в капсулах, которые защищают другие ингредиенты пищи от кислоты. Капсулы изготовляют трех типов: из частично гидрогенизированного растительного масла, мальтодекстрина и эмульгатора. Первый тип разрушается пои температуре плавления оболочки, второй — при растворении в воде, третий — при нагревании в воде. Преимуществом такой формы упаковки лимонной (и Других пищевых кислот) является контролируемая скорость освобождения кислоты из капсулы, равномерное распределение кислоты по всему объему без образования комков Пищевые кислоты в капсулах применяют в кулинарии — для увеличения срока хранения пудингов и начинок для пирогов, предотвращая реакцию между кислотой и крахмалом во время хранения, для увеличения срока хранения теста и т. д. Лимонная кислота в крупной фасовке должна храниться в закрытом помещении на деревянных стеллажах или поддонах при относительной влажности воздуха не выше 70 %. Гарантийный срок хранения лимонной кислоты — 6 мес со дня изготовления; при упаковке в ящики из гофрированного картона с внутренним вкладышем из подпергамента — 3 мес. Для хранения кристаллической кислоты большое значение имеет гигроскопичность. Под гигроскопичностью понимают свойство веществ поглощать водяные пары из воздуха независимо от характера связывания ими влаги. 3. Аппаратурная схема производства и экспликация
4. Изложение технологического процесса производства 4.1 Характеристика сырья и материалов Меласса в коцентрации 5% по сахару – используется для ферментации и посевной среды NH 4Cl концентрация 1% - используется для ферментации и посевной среды КН2РО4 конц. 1% - используется для ферментации и посевной среды ZnSO4 конц. 1% - используется для ферментации и посевной среды K4[Fe(CN)6] конц. 10% - используется для ферментации и посевной среды Пеногаситель – олеиновая кислота – используется для пеногашения Вода. Показатели для проверки - ХПК, БПК 4.2. Изложение стадий вспомогательных работ(ВР) и основного технологического процесса(ТП). ВР1. Подготовка стерильного воздуха. В процессе культивирования в посевном аппарате и ферментере растущая культура аэрируется кондиционированным стерильным воздухом под избыточным давлением 0,01 – 0,03 мПа для удовлетворения биологической потребности м/о и отвода продуктов их жизнедеятельности. Забор атмосферного воздуха происходит на высоте 5 метров над коньком здания. Подготовка воздуха для аэрации проводится следующим образом: -очистка воздуха от грубых механических взвесей (висциновые фильтры) -предварительное кондиционирование воздуха до нужной температуры -подача воздуха в компрессор -тонкая очистка воздуха от микроорганизмов (головной фильтр) -окончательная очистка в индивидуальном фильтре. На стадии предварительной очистки воздуха удаляется основная масса крупных частиц пыли диаметром 5-10мкм. В качестве фильтров предварительной очистки используют масляные фильтры. Для сжатия и нагнетания воздуха используют турбокомпрессоры, в которых сжатие воздуха происходит под действием центробежной силы. Сжатие воздуха сопровождается его нагреванием до 2200С. Поэтому после компрессоров воздух поступает в холодильник. Чтобы удалить из воздуха излишнюю влагу, его необходимо охлаждать до температуры ниже точки росы. Далее воздух поступает в головной фильтр КБ ВНИИФСа, представляющий собой стальной цилиндр со сферическим днищем и разъемной крышкой. Внутри него расположены сетки, между которыми уложены фильтрующий материал - стекловолокно ЦФД. Стерилизуется фильтр паром давлением 0,2 МПа при 133°С в течении 3 часов. Перебивку головного фильтра ведут – 1 раз в 2 – 3 месяца Далее очищенный воздух поступает в индивидуальные фильтры тонкой очистки и подается для аэрирования растущей культуры в посевном аппарате и ферментере. Для ферментера используется фильтр ЛАИК СП6/ 15 , посевного аппарата - фильтр ФТО – 60 .Фильтрующий материал, используемый для фильтров тонкой очистки, имеет коэффициент проскока 1х109 %, что обеспечивает требуемую стерилизацию воздуха, необходимого для развития микроорганизмов. Стерилизуют фильтры паром. Перебивку фильтров ведут: индивидуальных – 1 раз в месяц. ВР 2. Подготовка сырья для ферментации. Все жидкие компоненты среды поступают из транспорта в специальные сборники и хранятся на складе при 15 С. Всё сырьё при поступлении в цех проходит тщательную проверку и очистку. ВР 3.Подготовка пеногасителя Пpи выpaщивaнии кyльтypы нa cpeдax, oбpaзyющиx пeнy в пpoцecce фepмeнтaции для ee гaшeния в aппapaты пoдaeтcя жидкий пeнoгacитeль. Для пoлyчeния 0,05%-нoй эмyльcии пeнoгacитeля, в емкость вносят его концетрат, зaтeм paзбaвляют eгo дo необходимой концентрации. Эмyльcию пеногасителя cтepилизyют в специальном аппарате периодического действия при темпepaтype 123±2°C в тeчeниe 30 минyт во избежание внесения с ним инфекции в среду. Пocлe cтepилизaции пeнoгacитeль oxлаждают в тoм жe aппapaтe дo тeмпepaтypы 30-32°C, зaтeм подают через дозатор (Д1) в ферментер и посевной аппарат. ВР 4. Подготовка оборудования к загрузке Подготовка установок к работе заключается в их промывке и пропарке. При мойке установок сначала заполняют водопроводной водой (или раствором каустической соды) основную емкость, затем циркуляционный контур. После запуска насоса промывная жидкость начинает циркулировать по контуру. Далее устанавливают необходимую величину возврата промывной жидкости из основного контура циркуляции промывного раствора в циркуляционную емкость. Подпитывая систему водопроводной водой, ведут промывку до появления чистой воды на выходе в канализацию перед аппаратом разделения. Основные показатели процесса мойки: - температура водопроводной воды - 40°С - продолжительность процесса - 30 мин По окончании процесса выключают насос и сливают остатки воды из установки. Далее можно осуществить пропаривание аппарата путем подачи пара с давлением 0,3-0,4 МПа и отвода конденсата в канализацию. После подготовительных мероприятий необходимо произвести анализ воздуха внутри аппарата при помощи газоанализаторов. Концентрация СО2 и других летучих продуктов не должна превышать допустимую норму. Перед проведением работ по очистке и осмотру оборудования все аппараты должны быть надежно (с помощью заглушек) отключены от паровых и прочих коммуникаций. ТП 1. Выращивание посевного материала в лаборатории. ТП 1.1..Приготовление питательной среды ТП 1.2 Стерилизация питательной среды Проводится в автоклаве при температуре 120оС . ТП 1.3 Засев исходной культурой Исходная культура засеивается в пробирку, потом выращивание ведут в колбах и кюветах. ТП 2. Приготовление питательной среды для ферментёра и посевного аппарата ТП 2.1 Взвешивание мелассы ТП 2.2 Приготовление питательной среды Пoдгoтoвкy питaтeльнoй cpeды пpoизвoдят в реакторе (РС) путем смешивания ее компонентов. Реактор - этo цилиндрическая eмкocть, изгoтoвлeнная из нepжaвeющeй cтaли или из мaтepиaлoв c aнтикoppoзийным пoкpытиeм зaкpытoгo типa c мeшaлкoй и бapбoтaжным ycтpoйcтвoм для вoздyxa, пapa. B кpышкe тaкoгo cмecитeля пpeдycмaтpивaeтcя нecкoлькo ввoдoв, пpeднaзнaчeнныx для пoдaчи внyтpь реактора кoмпoнeнтoв cpeды, вoды.B нижнeй чacти eмкocти ecть oтвoдящий пaтpyбoк, чepeз кoтopый yдaляeтcя из aппapaтa пoдгoтoвлeннaя cpeдa и пoдaeтcя в пос.аппарат. |