Маркирование. литобзор маркирование. Создание новых перспективных гибридов огурца
 Скачать 29.36 Kb.
|
|
Создание новых перспективных гибридов огурца (Cucumis sativus L.) предполагает последующее получение промышленных партий гибридных семян, что в свою очередь, является процессом, сопряженым с риском генетического загрязнения и нуждается в контроле. Помимо создания гибрида, обладающего всеми интересующими нас признаками и получения семян, необходимо иметь возможность отслеживать качество семенного материала и соответствие его заявленному генотипу. Для того чтобы определить уровень гибридности семян у огурца в России чаще всего проводят грунт контроль. Этот метод основан на оценке морфологических признаков, на которые значительное влияние оказывают условия окружающей среды. Это, как правило, занимает не менее двух месяцев и влечёт дополнительные затраты. Грунт контроль требует высокой степени компетентности специалистов для проведения фенотипической идентификации сортовых признаков (Watcharawongpaiboon N. and Chunwongse J. Development and Characterization of Microsatellite Markers from an Enriched Genomic Library of Cucumber (Cucumis sativus). Plant Breeding February 2008, Volume 127, Issue 1 (pages 74–81))[2]. Сортовую чистоту оценивают в полевых условиях путем наблюдения за ростом и развитием культуры. Ее определяют по отношению, числа растений, типичных для данного сорта, к общему числу растений выращиваемой культуры. Сортовая чистота выражается в процентах. По сортовой чистоте семена овощных культур делят на три категории. В соответствии с утвержденными стандартами семена различных овощных культур первой категории должны иметь сортовую чистоту не менее 97…100 процентов, второй категории 95…98 процентов, третьей 85…95 процентов. Семена суперэлиты и элиты должны соответствовать требованиям, предъявляемым к первой категории, а высеваемые для размножения - не ниже второй категории. Для посева на товарную продукцию допускаются семена третьей категории. (ГОСТ 32592-2013) Метод молекулярного маркирования с использованием микросателлитов позволяет значительно сократить время и затраты на определение уровня гибридности семян. Такие маркеры как высоко полиморфные микросаттелиты или SSR (простые повторяющиеся последовательности), SCAR (амплифицированные регионы c охарактеризованной нуклеотидной последовательностью) и SNP (полиморфизм единственного нуклеотида) являются надёжными, рентабельными и поддаются анализу в больших масштабах. Внутривидовой полиморфизм у огурца относительно низок (Cucumis ativus L.) (от 3% до 8%), что обуславливает направленность на развитие SSR, SCAR и SNP маркеров и оптимизацию условий реакции ПЦР. Таким образом, используя уникальную стратегически применяемую методологию, включающую GeneTrapper (Ген охотник) (Life Technologies, Gaithersburg, Md.) был сконструирован набор из 110 SSR маркеров (Gennaro Fazio, Jack E. Staub, and Sang Ming Chung U.S. Department Agriculture, Agricultural Research Service, Vegetable Crops Unit, Department of Horticulture, 1575 Linden Drive, University of Wisconsin, Madison, WI 53706). С момента открытия ПЦР (Saiki et al., 1988) было разработано множество техник, для определения полиморфизма ДНК. Этот полиморфизм используется в генетике и селекции растений (Gupta and Varshney, 2000; Knapp, 1998; Lee, 1995; Staub et al., 1996c). Анализ фрагментов и последовательностей ДНК используется в работах по генетическому картированию (Bradeen et al,2001; Tanksley and Nelson, 1996), анализу генетической разнородности (Horejst and Staub, 1999), и в последнее время в маркер-опосредованной селекции (MAS) у разных видов сельскохозяйственных культур (Quarrie, 1996; Romagosa et al., 1999; Shen et al., 2001; Yousef and Juvik, 2001). Например, изоферментный анализ, RAPD (случайная амплификация полиморфной ДНК) и RFLP (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов)- маркеры используют у огурца для генетического картирования и анализа генетической разнородности (Dijkhuizen et al., 1996; Horejst et al., 2000; Kennard et al, 1994; Meglic and Staub, 1996ab; Serquen et al.,1997). Использование этих генетических маркеров было ограничено в связи с ограниченной генетической базой огурца (от 3% до 8% на бенд) (Horejst and Staub, 1999; Kner et.al., 1989). Высокий уровень полиморфизма был документально подтверждён у C. sativus и у Cucurbita and Citrullus видов семейства тыквенные при помощи SSR маркеров (Katzir et al., 1996). Четыре из семи SSR маркеров используемых для определения полиморфизма у 11 генотипов огурца позволили подсчитать генетическую разнородность которая варьировала в пределах от 0,18 до 0,64 (Katzir et al., 1996). Совсем недавно были созданы и протестированы на огурце 20 полиморфных SSR – маркеров для более детального определения их потенциальной ценности в генетическом анализе. Полиморфизм был определён в 12 из 20SSR локусов (60%) включая от двух до пяти аллелей в каждом протестированном SSR локусе (Danin Poleg et al., 2000; Danin Poleg et al., 2001). В настоящее время существует сравнительно большие базы данных молекулярных маркеров для огурца, которые включают изоферменты (Meglic and Staub, 1996b), RFLP (Dijkhuizen et al., 1996), RAPD (Horejst and Staub, 1999), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP)( Bradeen et al,2001, SSR (Danin Poleg et al., 2000), SCAR (Horejst et al., 1999) маркеры. Применение этих маркеров для оценки генетической разнородности, позволяет подразделять коммерческие сорта на рыночные классы и группировать их в U.S. National Plant germplasm system по географической близости и стране происхождения. Характеристика дополнительных полиморфных SSR, SNP и SCAR маркеров позволила бы увеличить точность оценки генетического сходства среди сортов огурца, а также в картировании качественных и количественных признаков. Несмотря на их высокую стоимость микросаттелиты играют важную роль в генетических исследованиях высших эукариот, таких как сладкий картофель (Ipomoea batatas L.,Lam.)(Buteler et al., 1999), маниока (Manihoi esculenta L.) (Chavarriagaaguirre et al., 1998), персик (Prunus persica L.) (Cipriani et al., 1999), ячмень (Hordeum vulgare L.) (Donini et al., 1998), бобы ( (Phaseoulus vulgaris L.) (Yu et al., 1999). Там где SSR полиморфизм может иметь высокую пропускную способность и недорогими технологиями анализа данных (например, анализ в агарозном геле) их кодоминантная природа и относительно высокий полиморфизм может сделать их подходящим для многих типов генетического анализа (Donini et al., 1998; Gupta et al., 1999). Также переход от RAPD маркеров к SCAR и SNP маркерами может повысить воспроизводимость маркеров (Michelmore et al., 1991, Staub et al., 1996a). Разработка технологий SSR маркирования огурца необходимый шаг для более полного анализа генома и применения этой информации для улучшения огурца. Оптимизация праймер-специфичных условий ПЦР. Потенциал микросаттелитных и других ПЦР маркеров в их широком применении широко обсуждался во многих работах (Donini et al., 1998; Gupta and Varshney, 2000; Powel et al., 1996). Мультиплексирование (т.е добавление нескольких маркеров в одну ПЦР-амплификацию ДНК) успешно использовалось при тестировании родителей у коз (Сapra hircus L. Bovidae) используя две мультиплексные системы, каждая содержащая 11 микросаттелитных локусов (Luikart et al., 1999). Мультиплексирование также использовалось у некоторых видов растений включая пшеницу (Triticum ssp.) (Donini et al., 1998; Gupta et al., 1999), яблоню (Malus x domestica Borkh.) (Hokanson et al., 1998) и виноград (Vitis ssp.) (Lamboy and Alpha, 1998). Однако во время мультиплексирования могут возникнуть технические трудности. Donini et al. (1998) сообщал что мультиплексирование ПЦР сильно зависело от выбора комбинации праймеров и редко от производимой амплификации, как последовательно, как, когда пары праймеров использовались индивидуально и, что фон (неспецифический) амплификации был общим для многих пар праймеров, что затрудняет использование мультиплексной ПЦР. Кроме того преимущественная амплификация меньших аллелей над большими, а также переменная плюс А модификация (нешаблонная адениляция 3' конца амплифицированной последовательности с помощью Taq полимеразы) в результате неправильной идентификации определенных генотипов радужной форели (Oncorhynchus микижи, лососевых, Walbaum 1792) (Фишбек и др.., 1999). Во время ПЦР каждая пара праймеров может дать различные продукты в зависимости от условий реакции (т.е. ПЦР смесь, температура и условия циклов) (Staub et al., 1996a), и характер ДНК фрагмента который амплифицирован (т.е. неоднократно или один раз) (Paglia и Morgante, 1998). Характеристики пар-праймеров могут быть такими, что они мешают ПЦР (т.е., кинетике реакции), в результате недостаточного разрешения предполагаемого мультиплексированного продукта праймера. В современных программах по селекции огурца большое внимание уделяют использованию гетерозисных гибридов с комплексной устойчивостью к наиболее вредоносным заболеваниям. Оценка уровня гибридности семян является важной задачей в семеноводстве гетерозисных гибридов. Наиболее удобными для этих целей являются молекулярные маркеры, их использование позволяет защитить авторские права и контролировать качество полученных семян. (Байназарова А.Н. Молекулярно-генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук (2009) |