экспрессия гена vasa. Удк 577. 218 Экспрессия гена vasa при регенерации тканей

• Название: Удк 577. 218 Экспрессия гена vasa при регенерации тканей
• Анкор: экспрессия гена vasa
• Дата: 12.10.2022
• Размер: 30.59 Kb.
• Имя файла: vasa.docx
• Тип: Документы; #729449

УДК 577.218

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА VASA ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ
Нерубащенко А.Д.¹
Научный руководитель - к.б.н. Ткачева Е.С.<sup>1,2

1</sup>Дальневосточный федеральный университет

г. Владивосток, Россия

²Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН,

г. Владивосток, Россия
Аннотация. Голотурии обладают уникальной способностью - эвисцерацией, при которой происходит удаление внутренних органов животного и их полное восстановление в течение 20 суток. Процесс регенерации сопровождается изменением активности различных генов. Методом ПЦР в реальном времени исследован уровень экспрессии гена vasa в тканях аквафарингеального комплекса голотурии Eupentacta fraudatrix на разных сроках регенерации. Обнаружено увеличение уровня экспрессии vasa в течение всего периода регенерации аквафарингеального комплекса, что свидетельствует о возможном участии этого гена в восстановлении соматических тканей.

Ключевые слова: vasa, ПЦР в реальном времени, Eupentactafraudatrix, регенерация, голотурии, эвисцерация.
Введение. Регенерация — процесс восстановления утраченных или поврежденных органов и тканей живых организмов с сохранением их функций. Представители иглокожих (Echinodermata) обладают ярко выраженными восстановительными способностями. Объектом исследования выбрана голотурия Eupentacta fraudatrix, для которой характерен процесс эвисцерации — самопроизвольного отбрасывания внутренних органов в ответ на раздражение. В ходе эвисцерации E. fraudatrix выбрасывает через ротовое отверстие аквафарингеальный комплекс, кишку (за исключением клоаки), часть гонады, иногда водное легкое. Естественные стимулы эвисцерации не ясны, однако замечено, что она происходит при ухудшении внешней среды (повышение температуры воды, опреснение, загрязнение). В лабораторных условиях выброс внутренних органов можно вызвать различными способами, например, воздействием электрического тока или введением в целомическую полость дистиллированной воды [1].

Во время эсвирации E. fraudatrix теряется пищеварительная система, имеющая энтодермальное происхождение. Передняя часть кишки регенерирует путем трансдифференцировки мезодермальных клеток целомического эпителия [2]. Кроме того, при эвисцерации также удаляется аквафарингеальный комплекс, включающий, в дополнение к начальным сегментам пищеварительной трубки, органы амбулакральной системы и нервное кольцо [1]. Показано, что многие гены имеют дифференциальную экспрессию в ходе регенерации тканей. В частности, были изучены некоторые гены (Wnt9, Bmp1, эпендимин, сывороточный амилоид A, сурвивин и морталин), играющие важную роль в регенерации кишечника у голотурий (Santiago-Cardona et al., 2003; Suarez-Castillo et al. al., 2004; Zheng et al., 2006; Mashanov et al., 2010, 2012). Для голотурии E. fraudatrix исследована динамика экспрессии генов Wnt и frizzled при восстановлении пищеварительной системы [3]. В настоящее время молекулярные механизмы регенерации аквафарингеального комплекса E. fraudatrix нуждаются в изучении.

Ген vasa является одним из маркеров клеток половой линии и используется для изучения происхождения и развития половых клеток и гонад. Этот ген был впервые идентифицирован у дрозофилы (Schüpbach, Wieschaus, 1986). Vasa входит в семейство РНК-хеликаз DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp), белков, которые связаны с молекулярными процессами РНК, включая транскрипцию, сплайсинг, транспорт РНК, биогенез рибосом, деградацию РНК, инициацию трансляции и экспрессию генов в органеллах [4]. Белки DEAD-box могут действовать как шапероны, которые раскручивают вторичные структуры РНК для облегчения их правильного сворачивания и взаимодействия с вспомогательными белками [5]. Показано, что гены vasa также функционируют в других типах клеток, отличных от клеток половой линии, а именно в мультипотентных клетках [6].

Материалы и методы. Исследования были выполнены на взрослых особях голотурий E. fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota), отловленных в акватории Амурского залива и содержавшихся в аквариумах при температуре 15°C. Эвисцерацию стимулировали инъекцией 0.5 мл 1% KCl в целомическую полость животных.

Тотальную РНК выделяли из аквафарингеального комплекса интактных животных и на разных этапах регенерации (3, 5, 7, 10, 14 и 20 сутки после эвисцерации) с использованием реагента ExtractRNA (Евроген) в гомогенизаторе TissueLyzer (QIAGEN). Полученные образцы РНК после обработки ДНКазой I (Thermo Scientific) были очищены набором GeneJet RNA Purification Kit (Thermo Scientific). Качественную и количественную оценку образцов РНК производили на спектрофотометре BioSpec-nano (Shimadzu), а также с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. кДНК синтезировали с использованием набора реактивов MMLV RT kit (Евроген).

Анализ динамики активности гена vasa проводили с использованием реактива qPCRmix-HS SYBR (Евроген) на амплификаторе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratoris). Расчёт относительного уровня экспрессии целевого гена на разных сроках регенерации осуществляли с применением 2-^ΔΔCt-метода [7], в качестве референсного гена были использован ген тубулина (Tub). Каждый образец был проанализирован в трёх независимых экспериментах с тремя повторами. Для реакции использовали праймеры:

RTVasa_F 5′-GAACGACTACCTCTTCCTGACGG -3′,

RTVasa_R 5′-GTACGCTTGCCCTGTTACCCTTG-3′,

Tub_F1 5′-TGTCAGGTCTGGTCCATTCGG -3′,

Tub_R1 5′- AGCACCCTCTGTGTAGTGTCCC-3′.

Результаты и обсуждение. Уровень экспрессии гена vasa во время регенерации аквафарингеального комплекса исследовали с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием тубулина (Tub) в качестве внутреннего контроля. Обнаружено, что при восстановлении аквафарингеального комплекса уровень экспрессии гена vasa увеличивается в 2-2,5 раза на 3-14 сутки регенерации по сравнению с экспрессией этого гена в нормальных тканях аквафарингеального комплекса. Можно предположить, что это связано с активным образованием зачатков органов, процессами миграции и дедифференциации клеток. К 14 суткам регенерации обычно, когда структуры почти сформированы, происходит усиленный рост тканей за счет высокой пролиферативной активности клеток. На 20 сутки, когда завершается морфогенез и начинаются ростовые процессы в тканях, уровень экспрессии гена vasa постепенно снижается, но остаётся в 1,5 раза выше, чем экспрессия этого гена в нормальных тканях (рис. 1).

Наличие активности гена vasa при восстановлении аквафарингеального комлекса E. fraudatrix подтверждает активность этого гена помимо половых клеток и в соматических тканях.



Рис 1. Динамика экспрессии гена vasa на разных стадиях регенерации аквафарингеального комплекса голотурии E. fraudatrix.

Выводы. Полученные данные демонстрируют изменение активности гена vasa при регенерации соматических тканей E. fraudatrix и позволяют предположить возможное участие гена vasa в регенерации аквафарингеального комплекса голотурии.
Список использованной литературы:

1. 
   Долматов И. Ю., Машанов В.С. Регенерация у голотурий. – Владивосток: Дальнаука. 2007. – 212 с.
   
2. 
   Mashanov V. S., Dolmatov I. Yu., and Heinzeller T. Transdifferentiation in holothurian gut regeneration. // Biol. Bull. 209 – 2005. – 184–193.
   
3. 
   Girich A. S., Isaeva M. P., Dolmatov I. Yu. Wnt and frizzled expression during regeneration of internal organs in the holothurian Eupentacta fraudatrix. // Wound Rep Reg 25 – 2017. – 828–835.
   
4. 
   Rosner A., Moiseeva E., Rinkevich Y., et al. Vasa and the germ line lineage in a colonial urochordate. // Developmental Biology 331 – 2009. –113–128.
   
5. 
   Lorsch J.R. RNA chaperones exist and DEAD box proteins get a life // Cell 109 – 2002. – 797–800.
   
6. 
   Gustafson E.A., Wessel, G.M. Vasa genes: emerging roles in the germline and in multipotent cells // Bioessays 32 – 2010. – 626–637.
   
7. 
   Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−Delta Delta C(T)) Method // Methods 25 – 2001. – 402–408.