сперма. В чем заключается приготовление разбавителей
 Скачать 28.19 Kb.
|
|
В ЧЕМ ЗАКЛЮЧАЕТСЯ ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗБАВИТЕЛЕЙ Назначение компонентов разбавителей В настоящее время для разбавления спермы применяют в ос-новном глюкозо- цитратно-желточные, гликокол-цитратно- желточ-ные, глюкозо-хелато-цитратные. молочные, медовые и ряд других разбавителей, которые позволяют использовать сперму в течение 2-3-х дней хранения при температуре 0°+2°с. Глюкоза и гликокол в разбавителях служат питательным энерге-тическим материалом и, предохраняя от потери электрического заряда, предотвращают агглютинацию спермиев. Цитрат натрия является естественным буфером спермы (рН 7,8-8,0), нейтрализует молочную кислоту и другие кислые продукты распада, понижает набухание коллоидов, связывает ионы кальция, участвует $ процессе дыхания спермиев. Торможение обменных процессов в спермиях осуществляется за счет температурного (при 0° с и минусовых температурах ) и кислот-ного анабиоза (углекислота, хелатон, органические кислоты), а также придание сперме студнеобразной консистенции при добавлении желатина или поливинилового спирта (однако последнее используется крайне редко).Повышение устойчивости спермиев к охлаждению и замораживанию проводится добавлением в разбавители лецитина (в желтке ку-риного яйца до 7 %) и глицерина (способствует витрификации, т.е. аморфному замораживанию биологических жидкостей без образования кристаллов). Приготовление разбавителей Разбавители готовят перед самым получением спермы. Некото-рые схемы рецептов разбавителей для краткосрочного и долговремен-ного хранения спермы Глоково-желточные разбавители готов ко пледукошим обраком.в стеклянную колбу отмеряют необходимое количество дистилики. панной волы, доводят ее до кины на рия, вы си пенивают согласно роранту глюкозу и лимоннокислый натрий, высыпают в колбу с волов. стеклянной палочкой размешивают мо полного растворения, охли клают до температуры 38-40°с. Затем берут чистое куриное яно протирают его ватным спиртовым тампоном и пробивают скорлупу с помощью обеззараженного окальнеля. Разламывают скорлупу на две половины и перекладывают желток из одной половины в другую, пока не стечет весь белок. Затем для полного удаления белка желток несколько раз перекатывают на фильтровальной бумаге. стерильных пинцетом прокалывают желточную оболочку и, придерживая её, сливают желточную массу в разбавитель из расчета 1 желток среднето куриного яйца (15,0 - 20,0) на 100 мл разавителя. Разбавитель с желтком тщательно перемешивают стеклянной палочкой После этого на каждые 100 мл среды добавляют бактериостати-ческие вещества спермосан-3 или пенициллин, стрептомицин и стреп-тоцид; 25 тыс. ед. соответствует 0,025 г вещества. Если невозможно отвесить требуемое малое количество антибиотиков, то содержимое флакона с антибиотиками растворяют в 2 мл дистиллированной воды и после этого к среде добавляют соответствующей объём раствора данного антибиотика. Например, если во флаконе содержится 500 тыс. ед., которые растворены в 2 мл дистиллированной воды, то на 100 мл среды надо добавить 0,1-0,2 мл раствора антибиотика, тщательно перемешивая его в разбавителе. Разбавление спермы После приготовления разбавителя получают от производителя сперму и оценивают её на густоту и подвижность. К разбавлению допускается сперма барана с оценкой не ниже, чем Г-8, сперма быка - Г-8 и с-8, сперма жеребца - 6, хряка - 7.Перед разбавлением спермы необходимо предварительно проверить качество приготовленного разбавителя путём смешивания па предметном стекле капель спермы и разбавителя и проверки активно-сти разбавленной спермы под микроскопом. Если активность спермы не понизилась, приступают к разбавлению всей спермы. степень разбавления спермы устанавливается в зависимости от густоты и подвижности спермиев. сперму быка разбавляют в отношении 1; 10; 1:15, 1:30; 1:50; барана- 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; хряка- 1:2; 1:3; 1:5; жеребца-1:2; 1:3; 1:4; 1:5. В целях предотвращения холодового удара в момент разбавления спермы разбавитель перед употреблением необходимо подогреть в теплой воде до температуры +25, +30°с. Рекомендуется медленно приливать разбавитель к сперме, а не наоборот. При разбавлении состав перемешивают стеклянной палочкой, с момента получения до разбавления спермы не должно проходить более 5-10 минут. Разбавитель можно хранить при комнатной температуре ( +20, +25°c) не более 6 часов, а при 0°с - в течение суток. Разбавление спермы барана проводят в спермоприемнике, доливая к сперме разбавитель. После смешивая спермы с разбавителем тот час же берут каплю спермы для оценки. Если подвижность спермиев снизилась, сперму бракуют, а разбавитель готовят заново. следует помнить, что иногда снижение подвижности бывает временным, а через 1-1,5 часа движе-ние спермиев полностью восстанавливается. ДОЛГОВРЕМЕННОЕ ХРАНЕНИЕ СПЕРМЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ Порядок работы Гибель спермиев вне организма при активном обмене вешеств происходит в результате истощения запасов энергетических веществ и предного денет вия станс окаливают полавино в обмена, Кроме того, отрицательное действие оказывают попавшие в сперму микробы и резкие колебания температуры. Поэтому для сохранения спермы необходимо во всех случаях переводить её в неактивное обратимое состояние, т. е. в состояние анабио-за путем снижения или полного прекращения обменных процессов. Основным методом длительного сохранения спермы быка, барана и жеребца является замораживание её в жидком азоте при температуре - 196° с, когда обмен веществ у спермиев практически прекращается. Для замораживания спермы необходимо соблюдать следующие условия: Сперму, разбавленную специальными средствами ( с глице-рином) выдерживают в течении 4-5 часов при температуре 0, +4° с для охлаждения и эквилибрации (уравновешивание сред), после чего замораживают в жидком азоте по принятой технологии. В течении всего срока хранения замороженной спермы необходимо поддерживать постоянную температуру - 196° с. Для перевозки и хранения замороженной спермы используют двустенные металлические сосуды различной емкости с вакуумной порошковой изоляцией (сосуды Дьюара, сД). суточный расход жидкого азота в них колеблется от 1 до 3%. При работе с сосудами Дьюара необходимо соблюдать нужные технологические приёмы технику безопасности. Перед осеменением животных на пунктах искусственного осе-менения, оттаянную сперму необходимо проверить на активность. Нельзя преждевременно оттаивать сперму или повторно её замораживать. Замороженную сперму быков можно доставлять в хозяйства 4 раза в год и использовать по мере надобности. Раз в месяц необходимо пополнять жидким азотом сосуды, в которых хранится сперма. Замораживание спермы быка в гранулах Во многих хозяйствах нашей страны в последние годы концен-трированную сперму быка замораживают в мелких гранулах ( 0,2 мл) по упрощенной технологии.Свежеполученную сперму после её оценки разбавляют в зависимости от концентрации в 2-4 раза средой следующего состава: Воды дистилированной-100 мл Лактозы-11.5 г Глицерина-5 мл Желтка курнных яиц -20мл Пенициллина и стрептомицина- по 30 тыс. Е.Д. Сразу перед разбавлением подогревают до +30, +35° с. Разбав-ленную сперму минут 10-15 выдерживают при температуре комнаты, а затем помешают в холодильник с температурой около 0° (+2, +4° с) на 4-6 часов. После охлаждения и эквилибрации сперму замораживают путём разливки в луночки фторопластовой пластины, укрепленной над жидким азотом в специальных емкостях. Пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5-10 см, в течение 1,5-2 минут, погружают в жидкий азот на 1-2 минуту. После чего пластинку поднимают, а гранулы ссыпают в полотняные мешоч-ки или металлические канистры, которые опускают на хранение в сосуды Дьюара. На пунктах искусственного осеменения каждую гранулу замороженной спермы (разовая доза) оттаивают в 1 мл тёплого (+38, +40°c) 2,9%-ного раствора лимоннокислого натрия. Каплю оттаянной спермы оценивают под микроскопом на активность и допускают к осеменению с оценкой не ниже 4 баллов. замораживание спермы быкя в соломинках (пайетах) Для этого метода используют полипропиленовые трубочки ви костью 0,25 мл. Сперму разбавляют пактово-фруктозо-раффиного-нагнисво-глицерино-желточной средой с таким расчетом, чтобы » панете содержалось не менее 15 млн. подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют с указанием наименования предприятия, клиники и номера быка, даты получения спермы. Для разбавления используют машину, автоматически заполняющую спермой соломинки и закупоривающую их с обеих концов стерильными шариками.Олин шарик используется как пробка поршень, а другой гермети-зирует соломинку. Можно соломинки заполнять спермой вакуумным способом, для чего применяют специальную вакуумную камеру. Для замораживания допускают сперму с оценкой по подвижности не ниже 8 баллов. Заполненные пайеты раскладывают на штативе; последние ставят для охлаждения в холодильник при температуре +4° с на 3-4 чася.После чего замораживают в газообразном азоте при температуре -120 - 130° с в течение 5 минут. Замороженную сперму хранят в специальном хранилище в жидком азоте при температуре - 196° с. Криоконсервацию спермы в соломинках осуществляют на авто-матической линии нового поколения в парах жидкого азота. В зави-симости от потребностей племпредприятия предусматривается авто-матическая система, рассчитанная на 420, 2400, 5250 соломинок по 0, 25 мл. Система позволяет контролировать температурный режим не только в камере, но и в соломинке; отражает и сохраняет все данные замораживания. Имеется возможность визуализации замораживания семени в реальном времени. Режим замораживания в автоматической системе происходит в следующей последовательности.После завершения процесса замораживания открыть крышку морозильной камеры и расфасовать соломинки согласно кличкам производителей в предварительно подготовленные стаканы или тубы.Следить на экране компьютера за повышением температуры, она не должна быть выше -106°С. В случае повышения температуры закрыть крышку замораживателя и включить вентилятор, опустить температуру до -142°C. После окончания цикла замораживания пустые рамки погрузить в морозильную камеру, закрыть вентили на сосуде. Нажать кнопку «Сброс азота» (желтая, на блоке внизу) и выбрать на экране компьютера значок «Пуск нагрева». Дождаться окончания нагрева до 45°С. Выключить систему - отжать кнопки «Сброс азота», «Вентилятор», «Нагревание» и отпустить красную кнопку on/ off.Для оттаивания спермы в соломинках необходимо использовать водяную баню или специальный оттаиватель, термометр, анатомиче-ский пинцет длиной 25-30 см, ножницы, стерильные марлевые сал-фетки, полотенце, тампонницу с тампонами, пропитанными 96°-ным спиртом-ректификатом, микроскоп с нагревательным столиком, предметные и покровные стекла, 2,9%-ный раствор лимоннокислого натрия и защитные очки.После очистки и дезинфекции рабочего стола раскладывают весь необходимый инструмент, включают водяную баню или оттаива-тель и нагревательный столик с микроскопом, на который кладут чистые предметные и покровные стекла.Как только температура водяной бани или оттаивателя достир-нет рабочего диапазона (38-40°С), надевают защитные очки, открывают крышку сосуда Дьюара, охлаждают погружением в жидкий азот бранши пинцета, быстро подтягивают к верхней трети горловины сосуда канистру со спермой и извлекают одну соломинку, энергично стряхивают с нее остатки жидкого азота и быстро переносят в оттаи-ватель или водяную баню. Сперму в соломинках оттаивают в водяной бане или оттаивателе при температуре 38-40°С в течение 8-10 с. Соломинку после оттачеле ния насухо протирают марлевой салфеткой и, держа за конец, встряхи-вают, чтобы воздушный пузырек опустился к пробке. Острыми ножни-пами или специальным приспособлением отрезают пробку с одного конна соломинки, заправляют соломинку в шприи для осеменения, надевают санитарный чехол, затем, аккуратно нажимая на порщень шприца, выдавливают каплю спермы на предметное стекло, лежащее на нагревательном столике микроскопа, стеклянной палочкой добавляют каплю 2,9%-ного раствора лимоннокислого натрия, перемешива-ют, накрывают покровным стеклом и оценивают по подвижности. От-таянную сперму необходимо использовать в течение 10-15 мин.Процесс оттаивания семени в соломинках происходит в определенной последовательности. Замораживание спермы барана При круглогодовом (10 мес.) взятии сперму в течение недели от барана рекомендуется получать по 5-6 эякулятов дуплетной садкой с интервалами 10-15 мин. и промежутками между дуплетами - 48 часов. Для замораживания сперму барана разбавляют двумя средства-ми: лактозо-желточной (ЛЖ) и лактозо-желточно-гуммиарабико-трис-цитратно-глицеритновой (ЛЖГТЦГ). Состав лактозо-желточной среды: Вода дистиллированная, мл - 100 Лактоза, г - 12 Желток свежего куриного яйца, мл - 20 Спермосан, тыс. Ед. - 25 Для ее приготовления в чистую стерильную колбу вносят навес-ку лактозы, заливают дистиллированной водой и закрывают пищевой алюминиевой фольгой или пергаментной бумагой, кипятят в течение 1 часа на водяной бане. После охлаждения раствора до 40° с вводят в него "спермосан-3" и желток куриного яйца. Состав лактозо- желточно- гуммиарабико-трис-цитратно-глицериновой среды Вода дистиллированная, мл - 100 Лактоза, г- 14,5 Гуммиарабик (порошок), г 6 Трис (оксиметил) - аминометан, мг – 600 Лимонная кислота, мг - 270 Желток свежего куриного яйца, мл - 20 Глицерин, ч. д. а., мл - 17 "спермосан-3", 1ыс. ед. - 25 Для приготовления среды в стерильную колбу вносят навеску лактозы, гуммиарабика, трис-аминометана и лимонной кислоты. Тиа-тельно перемешивают; заливают необходимым количеством горячен кипяченой воды и закрывают колпачком из фольги или пергаментной бумаги, помещают в кипящую водяную баню до полного растворения всех компонентов. Затем в колбу вносят глицерин и раствор фильтру-ют через слой стерильной ваты. После чего, закрыв колбу колпачком, раствор стерилизуют на водяной бане в течение 2-х часов. В охла-ждённый до 40° с раствор добавляют "спермосан-3" и желток курино-го яйца. Приготовленные среды можно использовать в течении 4-х часов при температуре +24-26° с.Полученную от баранов сперму используют для разбавления и замораживания с оценкой по подвижности не ниже 8 баллов и концентрацией не менее 2,5 млрд. спермиев в 1 мл.Сперму разбавляют в два приема. Вначале к одному обьёму спермы добавляют ЛЖ среды, имеющей температуру +28° с. среду вливают осторожно по стенке спермоприемника при постоянном помешивании.После этого к одному объёму получившейся разбавленной спермы добавляют один объём ЛЖГТПГ среды с температурой +24° с.Окончательное разбавление спермы получится в 3 раза. Разбав-ленную сперму разливают во флаконы и выдерживают в холодильни-ке при температуре +2-5° с в течение 2-х часов.После чего её замораживают в гранулах по 0,2 см в луночках на пластинах сухого льда или фторопластовых пластинках, укреплённых над жидким азотом.Гранулы замороженной спермы после выборочной проверки на активность собирают в алюминиевые тубы или ссыпают в канистры и хранят в жидком азоте.Для оттаивания гранул замороженной спермы на пунктах применяют специальное устройство (оттаиватель), состоящий из внешнего и внутреннего сосудов, между стенками которого заливают горячую воду с температурой +75-80° с. с нижней части внутреннего сосуда (кюветы) находится отверстие для оттока оттаявшей спермы в под-ставленный флакон.Гранулы спермы для оттаивания ссыпают в кювету и через 8-12 секунд из нижнего отверстия оттаявшая сперма начинает стекать во флакон. Оттаивают сперму в количестве не более 15-20 доз и используют после проверки с активностью не ниже 4-х баллов в течение 15 минут. Замораживание спермы жеребца Для замораживания пригодна сперма с подвижность спермиев не ниже 5 баллов и концентрацией не менее 150 млн. спермиев в 1 мл. Полученную и профильтрованную (через 4 слоя марли) сперму после оценки разбавляют б 4-5 раз одной из следующих сред: лакто- хелато-цитратно- желточной (ЛХЦЖ) ИлИ лактозо-желточно- сульфатной (ЛЖс). Состав ЛХЦЖ: лактоза - 10 г. желток - 1,6 г, 4,2 %-ный раствор двууглекислой соды - 0, 2 мл, 35,7 % раствор цитрата натрия - 0,25 мг, хелатон - 100 мг, глицерин - 3,5 мл, вода дистиллированная. Состав ЛЖс: лактоза 10 г, сульфат аммиака - 150 мг. желток - 1,6 г, глицерин -3,5 мл, вода дистиллированная. Раздавленную сперму охлаждают в холодильнике до близкой к 0° с (+2 -4° с) и выдерживают при такой температуре 2 часа. После чего в виде гранул или в алюминиевых пакетах в холодном газе над поверхностью жидкого азота.При замораживании в виде гранул сперму наносят по 0,2 мл в лунки на поверхности сухого льда. Через 5 минут гранулы замороженной спермы собирают и упаковывают в алюминиевые тубы по 125-130 штук (это составляет разовую дозу в 25 мл). Тубы с гранулами помещают на хранение в жидкий азот. При замораживании спермы в парах жидкого азота, её предварительно разливают по 25 мл в охлажденные алюминиевые пакеты.Замораживают сперму в сосудах Дьюара или стационарных хранилищах с помощью специальных устройств, которые позволяют автома-тически держать сперму на заданном расстоянии над жидким азотом.Устройство состоит из пенопластового поплавка, съёмного держателя (металлического сита) для ёмкостей со спермой и металлического кольца-испарителя для увеличения интенсивности испарения азота.Пакеты со спермой помещают в держатели, которые вместе с поплавком переносят на поверхность жидкого азота. Испаритель опускают в экидкий азот и контейнер закрывают крышкой (расстояние от пакета ло жидкого азота - 20 мм). Через 5 минут пакеты с замороженной спермой переносят в хранилище с жидким азотом. Для оттаивания гранулированной спермы тубы вынимают из жидкого азота, вскрывают, я гранулы быстро пересыпают ровным слоем в коническую колбу. Колбу погружают в водяную баню пои температуре 38-40° с, слегка взбалтывая круговыми движениями в те-чение 1-2 минут до полного исчезновения гранул. Для оттаивания спермы, замороженной в алюминиевых пакетах, их быстро переносят пинцетом из жидкого азота на 1-2 минуты в во-ляную баню при температуре 40° с. Пакет, вынутый из воды, протирают стерильной марлей, затем спиртовым тампоном, обрезают стерильными ножницами край пакета и после проверки качества сперму используют для осеменения кобыл. Подвижность в оттаявшей сперме должна быть не ниже 2-х баллов. Доза для осеменения (25 мл) содержит не менее 300 млн. подвижных спермиев. Техника безопасности при работе с жидким азотом При работе с жидким азотом необходимо соблюдать правила техники безопасности во избегании несчастных случаев. Работать нужно в защитных очках, кожаных рукавицах или перчатках. Попадание жидкого азота на незащищенные участки кожного покрова вызывает ожог (обморожение). При попадании жидкого азота на открытый участок тела, его необходимо быстро смыть водой. При заливке сосуда азотом нельзя заглядывать в горловину, т. к. может произойти выброс жидкого азота вследствие образования большого количества газа. Помещение, где находится сосуд с жидким азотом должно быть проветриваемое, т. к. повышение концентрации азота вызывает у людей головную боль и даже отравление. сосуд в помещении не должен находиться около источников тепла. При эксплуатации сосуда Дьюара нельзя плотно закрывать его горловину, т. е. накапливающиеся газы будут повышать давление внутри сосуда и он может взорваться. Во время транспортировки сосуды Дьюара с жидким азотом необходимо хорошо закреплять во избежание их падения и возможного взрыва. В целях предотвращения накопления в сосуде взрывоопасной смеси от обогащения жидкого азота кислородом производят контроль его с помощью переносного газоанализатора ГХП-3. Такой анализ проводят в хранилищах раз в год, а в сосудах на пунктах - раз в 6 месяцев. После накопления кислорода в количестве 15% сосуд выносят на улицу и опорожняют. |