ПЕЧАТЬ бх методы очистки и выделения белков. Выделение и очистка белков представляет собой
 Скачать 45 Kb.
|
|
Введение. Выделение и очистка белков представляет собой комплекс методов, направленных на получение чистого препарата определенного белка из сложной смеси, такой как клеточный экстракт. Разделить различные белки возможно на основе различий в их свойствах, таких как молекулярная масса, размер молекул, специфичность связывания с определенными веществами, а также растворимость, заряд, которые зависят от температуры, pH, ионной силы раствора и других факторов. Этапы выделения и очистки белков. Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:
Методы разрушения биологического материала. Для разрушения биологического материала используют следующие методы: метод гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также метод «азотной бомбы». Гомогенизация ткани – это метод разрушения биологического материала, при котором ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о стенки сосуда. В результате ткань становится однородной, то есть гомогенной. При этом используют: ножевые гомогенизаторы типа Уорринга; пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма; шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов. Метод попеременного замораживания и оттаивания льда; В результате попеременного замораживания и оттаивания под действием кристалликов льда происходит разрыв клеточной стенки. Метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t° 0° или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию. Экстракция белков. Экстракция белков – перевод белков в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно. Измельченную ткань заливают экстрагентом, в качестве, которо го используют 8-10% растворы солей, буферные смеси, органические растворители, а также неионные детергенты - вещества, нарушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами, между белковыми молекулами. Однако ими пользуются осторожно, чтобы не нарушить третичную (четвертичную) структуру белков. Из органических соединений используют водные растворы глицерина и слабые растворы сахарозы. Так как растворению и стабилизации белков способствуют кислые и слабощелочные среды, то в качестве буферных смесей исполь зуют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси. Нерастворимые части ткани осаждают центрифугированием. В надосадочной жидкости содержатся растворимые белки. Очистка и фракционирование белков. Высаливание. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку. Выделяют 2 способа – высаливание и метод хроматографии. Высаливание. Высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов. Механизм высаливания: добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов натрия и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания. После удаления высаливающего агента белок вновь приобретает способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства. На величину высаливания оказывают влияние природа и концентрация соли; рН-среды; температура. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH4)2SO4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH4)2SO4 выпадает осадок). Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:  Ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V) Метод Кона. Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие to –0+8oС), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков. Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей. Очистка и фракционирование белков. Методы хроматографии. В настоящее время существует много разновидностей хроматографии. Хроматографические методы основаны на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. Неподвижная фаза представлена жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул. Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии. Электрофорез белков Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе. Ионообменная хроматография Метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли вымываются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок. Ультрацентрифугирование Метод разделения основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость осаждения веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге пропорциональна их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 часов более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой. После расслоения белковых фракций дно кюветы прокалывают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз. Очистка белков от низкомолекулярных примесей. Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью. Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют. Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации. Заключение Выделение индивидуальных белков из органов и тканей занимает важное место в биохимических исследованиях. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией. Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении. Список используемой литературы:
|