вирусология в вопросах и ответах. Вопросы к экзамену по ветеринарной вирусологии история вирусологии. Роль вирусов в инфекционной патологии животных человека
 Скачать 344.5 Kb.
|
|
ВОПРОС №49 « ПЕРВИЧНО-ТРИПСИНИЗИРОВАННЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК. ИХ ДОСТОИНСВА И НЕДОСТАТКИ. ПРИМЕНЕНИЕ В ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ». ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации. ВОПРОС №50 «ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ВИРУСОВЛОГИИ. ТРЕБОВАНИЯ К ПОСУДЕ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КК, ЕЕ ОБРАБОТКА». Наиболее широко используют при работе с КК растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллированной воде с добавлением различных солей и глюкозы. Эти сбалансированные солевые растворы используют для приготовления всех питательных сред, т.к. они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Их же применяют для отмывания от ростовых сред, разведений вируса и другого. При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена – используют для снятия клеток со стекла. Питательные среды (далее ПС) – различают: 1)естественные среды, которые состоят из смеси солевого раствора, сыворотки крови, тканевого экстракта, коровьей амниотической жидкости и др. Количество компонентов варьирует. Используют их редко. 2)искусственные ПС – ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат и др. Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добавляют индикатор феноловый красный для определения концентрации водородных ионов. Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют АБ: пенициллин и стрептомицин по 100ЕД\мл. Все ПС делят на 2 группы: ростовые – обеспечивают жизнь и размножение клеток; поддерживающие – обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не их размножение (они не содержат сыворотки крови). Посуда – качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Она д\б стерильной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для культивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различные пипетки, флаконы для ПС и растворов, колбы различной вместимости. Обработка стеклянной посуды состоит из нескольких этапов: 1)инфицированную посуду погружают в 2-3% раствор NaOH на 5-6 часов; 2) споласкивают в 3-4 сменах водопроводной воды; 3) замачивают в 0,3-0,5% растворе порошка; 4) тщательно моют с помощью ерша в теплом растворе порошка; 5) споласкивают в нескольких сменах водопроводной воды; 6)споласкивают в дистиллированной воде, содержащей 0,5% HCl; 7)споласкивают 4-5 раз водопроводной водой и в 3 сменах дистиллированной воды; 8) сушат в сушильном шкафу; 9)монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу или автоклавируют. ВОПРОС №51 «ПРИНЦИП ЗАРАЖЕНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ВИРУССОДЕРЖАЩИМ МАТЕРИАЛОМ. ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК». Для заражения отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные АТ и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют на 1-2 часа при 22-37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Вируссодержащий материал удаляют из емкостей и наливают поддерживающую среду. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию; по положительной реакции гемадсорбции; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства. ВОПРОС №52 «МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРИОНОВ ВИРУСОВ И ВИРУСНЫХ ТЕЛЕЦ-ВКЛЮЧЕНИЙ, ИХ ПРАКТИЧЕСКЕ ЗНАЧЕНИЕ». Обычно удается рассмотреть вирионы вирусов и установить их структуру с помощью электронной микроскопии, позволяющей различать объекты размерами до 0,2-0,4 нм. Обнаружение с помощью электронной микроскопии в материале от больных животных вирионов может служить доказательством наличия вирусов в этом материале и в некоторых случаях используется для диагностики вирусных болезней. Но этот метод технически сложный и дорогостоящий, не позволяет точно идентифицировать обнаруженный вирус. В световой микроскоп удается увидеть только вирионы оспенных вирусов на пределе видимости. Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура, местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале. Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Для телец-включений, образуемых разными вирусами, методы окраски различны. Разработано много рецептов окраски. Среди них есть и универсальные, к которым относится окраска гематоксилин-эозином. |