биочип. Возможности биологических микрочипов в скрининге колоректального рака
 Скачать 2.44 Mb.
|
|
В.И. Бутвиловская, В. Р. Чечеткин, А.А. Тихонов, Сидоров Д.В., Н.В. Шилова, Н.В. Бовин, А.Ю. Рубина . Возможности биологических микрочипов в скрининге колоректального рака 2017 г., Москва Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ, Соглашение о предоставлении субсидии № 14.604.21.0103 от 05 августа 2014 г., уникальный номер научного исследования RFMEFI60414X0103. ФГБУ Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Биологический микрочип (биочип, microarray) Биологический микрочип - массив элементов, каждый из которых содержит иммобилизованные молекулярные зонды: белки, ДНК, гликаны. Биочип является инструментом для параллельного мультипараметрического анализа взаимодействий различных биологических молекул. Отличия 3D - гидрогелевых биочипов от 2D- биочипов • сохранение нативной структуры иммобилизованных биомолекул • высокая эффективность иммобилизации по сравнению с поверхностным слоем (в пересчете на единицу поверхности) • повышение чувствительности анализа • длительный срок хранения Два подхода к созданию биологических микрочипов: 2D и 3D биочипы Иммобилизованные молекулы Исследуемые молекулы Иммобилизация на поверхности (2D) Иммобилизация в гелевой ячейке (3D) Робот для нанесения гелевых элементов. Диаметр гелевого элемента зависит от диаметра используемого пина 100 мкм. Объем ячейки - 1 нл. Технология изготовления 3D-биочипов иммобилизованный антиген иммобилизованные антитела анализируемые антитела анализируемый антиген конъюгаты детектирующих антител и флуоресцентной метки Общий принцип иммуноанализа на биочипе Современная диагностика колоректального рака Золотой стандарт – колоноскопия IN VITRO диагностика колоректального рака - Гваяковый тест – анализ кала на скрытую кровь - Определение гемоглобина в кале иммунохимическим методом - Определение ДНК в кале - Определение опухолевых антигенов СEA и СА 19-9 в сыворотке крови Многопараметрический анализ в диагностике онкозаболеваний Колоректальный рак Актуальность проблемы Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных заболеваний среди населения индустриальных стран. Заболеваемость КРР в промышленно развитых странах колеблется между 42 случаев на 100 000 в год в США и 89 в Японии и является одним из главных раков развитых стран. Смертность от КРР также очень высока и колеблется от 10% всех онкологических смертей в США и около 13% в Японии. В Российской Федерации эта цифра 42% (http://www.who.int/cancer/country-profiles/en/). Учитывая тот факт, что на ранних этапах КРР развивается с минимальными клиническими симптомами особую роль играет ранняя диагностика. Современная диагностика колоректального рака ЗОЛОТЫМ СТАНДАРТОМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРР ЯВЛЯЕТСЯ КОЛОНОСКОПИЯ, однако более 60% пациентов отказываются от проведения колоноскопии из-за болезненных ощущений, поэтому данный метод не может быть использован для скрининга КРР. IN VITRO диагностика колоректального рака В настоящее время не существует ни одного 100% специфичного метода молекулярной диагностики колоректального рака. - Гваяковый тест – анализ кала на скрытую кровь до недавнего времени был единственным способом скрининга, но не позволял существенно сократить смертность от КРР из-за низкого уровня диагностической специфичности, часто давал ложно-положительных реакций, а также не выявлял ранние стадии рака (например, тесты Hemoccult II (Smith Kline Diagnostics) и Hemoccult II Sensa (Smith Kline Diagnostics)); - Определение гемоглобина в стуле пациента иммунохимическим методом (например, тесты HemeSelect (SmithKline Diagnostics) и InSure (Enterix Inc.)) Иммунохимическое тестирование не обладает высокой чувствительностью, его рекомендуют использовать в промежутках между колоноскопическими наблюдениями для выявления пропущенных или быстро развивающихся онкозаболеваний; - Определение ДНК в стуле пациента- новый стремительно развивающийся метод; масштабные скриниговые исследования показали, что тест на ДНК имеет более низкий уровень чувствительности по сравнению с анализом кала на скрытую кровь, к недостаткам можно отнести высокую стоимость (более 20 000 руб. за тест); - Определение ракового эмбрионального антигена РЭА и антигена СА 19-9 в сыворотке крови пациента применяют для мониторирования лечения КРР. Однако этот способ не подходит для раннего выявления заболевания. NSE CEA Легкие NSE Мозг AFP CEA Печень CA 72.4 CA 19.9 Желудок CEA TG CT Щитовидная железа CA 15.3 CEA Молочная железа CA 19.9 CEA Прямая кишка Free PSA PSA Простата Свободный HCG AFP Яички CA 72.4 CA 125 Яичники CEA CEA CA 19.9 Эндометрий Свободный HCG CEA Трофобласт Маркеры солидных опухолей CA 15.3 CEA Поджелудочная железа Cyfra 21-1 ОНКОАССОЦИИРОВАННЫЕ ГЛИКАНЫ sp3 = -O(CH2)3NH2, sp4=Gly-NHCOCH2NH2 Инкубация с образцом - конъюгат проявляющих антител с флуоресцентным красителем Су5 - антиген - иммобилизованные антитела Инкубация с проявляющими антителами Антитела в сыворотке крови пациента Иммобилизованные сахариды Антитела против IgG IgA IgM человека Стрептавидин – Су5 СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОАНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПАХ No. Олигосахариды Наименова ние Молекул. вес, a.u. 1 GalNAc a -sp3 Tn 278.3 2 Neu5Ac a 2-6GalNAc a -sp3 SiaTn 569.6 3 Fuc a 1-4 GlcNAc -sp3 Neu5Ac a 2-3Gal 1-3 SiaLe A 877.9 4 Gal 1-3GlcNAc -sp3 Le C 426.4 5 Fuc a 1-2Gal 1-4 GlcNAc -sp3 Fuc a 1-3 Le Y 732.7 6 Gal 1-3GalNAc a -sp3 TF 440.5 7 Manβ1-4GlcNAcβ-sp3 Manβ1- 4GlcNAcβ 439.4 Определение антител к гликанам Определение концентрации онкомаркеров Список олигосахаридов, иммобилизованных на биочипе Антиген Пара антител АФП XFP-4 / XFP-2-Cy5 ХГЧ XF-1 / XH-51-Cy5 РЭА CEA-1 / CEA-10-Cy5 CA 125 X-52 / Ovk95-Cy5 CA 15-3 X-19 / X-19-Cy5 CA 19-9 C241 / C241-Cy5 ПСАобщ PSA-36 / PSA-66-Cy5 ПСАсвоб PSA-30 / PSA-66-Cy5 НСЕ NSE-17 / NSE-21-Cy5 Список антител, иммобилизованных на биочипе Увеличение числа заболевших колоректальным раком в России диктует необходимость создания многопараметрических диагностических тест-систем, способных выявлять наличие онкологического заболевания на ранних стадиях. Колоректальный рак занимает третье место по распространенности среди населения индустриальных стран. Несмотря на биотехнологические инновации последних лет, диагностическую аппаратуру, новые химиопрепараты, пятилетняя выживаемость пациентов в РФ не превышает 36%. Поэтому поиск эффективных диагностических маркеров различной природы (белки- онкомаркеры, антитела к онкоассоциированным гликанам и др.) и их комбинаций, называемых серологическими сигнатурами, для раннего обнаружения колоректального рака остается актуальной задачей. В данной работе поиск сигнатур осуществлялся с помощью гидрогелевых микрочипов с полусферическими гелевыми ячейками, расположенными на стеклянной подложке, в которых в качестве молекулярных лигандов иммобилизованы белки и олигосахариды. Были исследованы сыворотки пациентов из трех когорт: - 33 сыворотки пациентов с колоректальным раком (CRC) - 69 сывороток здоровых доноров (HD) - 27 сывороток пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (IBD) Количественное определение онкомаркеров СЕА, СА 19-9, СА 125, СА 15-3, HCG, AFP, НСЕ, ПСА общ., ПСА св. в сыворотках крови пациентов из трех когорт проводили иммунофлуоресцентным анализом при помощи биочиповой тест-системы, ячейки биочипа содержали иммобилизованные антитела. Определение уровня антитела к онкоассоциированным гликанам проводили иммунофлуоресцентным анализом на биочиповой тест-системе, ячейки биочипа содержали онкоассоциированные гликаны (SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc), а так же антитела к иммуноглобулинам человека IgG, IgA, IgM. Статистический анализ полученных данных и последующий ROC- анализ позволил сформировать диагностическую сигнатуру, состоящую из девяти онкомаркеров, четырех антигликановых антител и уровня иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM, позволяющую выявлять колоректальный рак надежнее, чем традиционный метод определения РЭА и СА 19-9 в сыворотке крови пациента. ОПИСАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТОК КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ (А) Флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа, полученное в программе GenePix Pro 6.0 (Б) Схема проведения анализа на биочипе 1- иммобилизованный гликан, 2- иммобилизованные антитела против иммуноглобулинов человека (IgG, IgA, IgM) , 3- анализируемый компонент из сыворотки крови человека, 4- конъюгат антител против (IgG, IgA, IgM), меченный биотином, 5- конъюгат стрептавидина с Су5. А В Процедура иммуноанализа онкомаркеров на 3D биочипе Инкубация биочипа с сывороткой крови Инкубация с флуоресцентно- меченными антителами Регистрация сигналов флуоресценции, анализ данных 13 GenePix 4200F СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ где TP (True Positives) – верно классифицированные положительные примеры (в нашем случае правильные положительные диагнозы); TN (True Negatives) – верно классифицированные отрицательные примеры (правильные отрицательные диагнозы); FN (False Negatives) – положительные примеры, ложно классифицированные как отрицательные (ошибка I рода). Это так называемый "ложный пропуск" – когда интересующее нас событие (онкозаболевание) ошибочно не обнаруживается; FP (False Positives) – отрицательные примеры, ложно классифицированные как положительные (ошибка II рода); Это ложное обнаружение болезни, т.к. при отсутствии события ошибочно выносится решение о его присутствии. В ROC анализе чувствительность и специфичность бинарной модели рассчитывают по формулам: Чувствительность и специфичность бинарной модели определения заболевания стремится к 100% (площадь под ROC-кривой стремится к 1), если количество детектируемых моделью ложноотрицательных или ложноположительных диагнозов заболевания стремится к нулю. Статистическая обработка данных анализов (концентрация онкомаркеров, флуоресцентные сигналы от гликочипов, полученные после проведения иммуноанализа на чипах) проводилась с помощью программ MedCalc Version 11.4.2.0 and Statistica Version 8.0. Для оценки прогностической способности тест-систем, в доказательной медицине значительное распространение получил метод анализа ROC-кривых. Этот метод позволяет сравнить эффективность выявления патологического состояния организма при использовании различных альтернативных диагностических систем. ROC-кривые представляют собою графики зависимости истинно положительных (TP) от ложноположительных решений (FP), получаемых наблюдателем при оценке результатов исследования. Чем больше площадь под ROC- кривой, тем выше диагностическая эффективность данного фактора. Метод определения диагноза считается превосходным, если площадь под ROC-кривой AUC=0.9–1.0; очень хорошим при AUC=0.8-0.9; хорошим при AUC=0.7– 0.8; удовлетворительным при AUC=0.6–0.7; и неудовлетворительным при AUC=0.5–0.6. Случайное предсказание соответствует AUC=0.5. Для количественной оценки эффективности диагностики подбираются две группы пациентов: без патологических изменений (здоровые) и с определенным заболеванием (синдромом). Принципом ROC-анализа является сопоставление чувствительности (Se) и специфичности модели (Sp) по уровню ложноположительных диагнозов. Для расчета чувствительности и специфичности, оперируют не абсолютными показателями, а относительными – долями (rates), выраженными в процентах: Доля истинно положительных примеров TPR (True Positives Rate): Чувствительность модели (Sensitivity) – это доля истинно положительных случаев: Специфичность модели (Specificity) – доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью: Box-and-wiskers диаграмма. Распределение флуоресцентных сигналов полученных на гликочипах от ячеек, содержащих иммобилизованные антитела к иммуноглобулинам (IgG, IgA, IgM) человека: здоровые доноры (HD); пациенты с колоректальным раком (CRC) ; пациенты с синдромом раздражённого кишечника (IBD). Границами ящика служат 25-й и 75-й процентили соответственно, линия в середине ящика — медиана (50-й процентиль). Концы усов — края статистически значимой выборки (без выбросов). ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IgG, IgA, IgM в сыворотках пациентов из трех когорт ROC- кривая IgG IgA IgM модель «Oncology» , AUC= 0,663 ROC- кривая IgG IgA IgM модель «Disease» , AUC= 0,747 ROC- кривая IgG IgA IgM модель «CRC/IBD", AUC = 0.590 В нашем исследовании для ROC- анализа были рассмотрены следующие модели: 1. Группа пациентов с диагнозом колоректальный рак и группа здоровых пациентов: модель “Oncology” (CRC=1, IBD=0, HD=0); 2. Группа пациентов с заболеваниями кишечника (колоректальный рак, воспалительные заболевания кишечника) и группа здоровых пациентов: модель ”Disease” (CRC=1, IBD=1, HD=0); 3. Группа пациентов с диагнозом колоректальный рак и группа пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника: модель “CRC/IBD” (CRC=1, IBD=0). Такой подход к группировке диагнозов позволил в модели “Oncology” выделить случаи CRC; в модели ”Disease” - отличить больных пациентов от здоровых доноров; и, наконец, в модели “CRC/IBD” отличить случаи CRC от воспалительных заболеваний кишечника. ВЫВОД: Распределение уровней иммуноглобулинов неоднородно для каждой из когорт пациентов, причем содержание иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) изменялось в группе онкобольных (CRC) с боʹльшим разбросом от среднего значения (Box-and-wiskers диаграмма). Оказалось, что уровень иммуноглобулинов (IgG+IgA+IgM) , определяемый в сыворотке крови пациента, сам по себе является значимым прогностическим фактором . Так, для модели “Oncology” AUC = 0.66 (рис. А), для “Disease” AUC = 0.74 (рис. В) для модели “CRC/IBD” уровень иммуноглобулинов (IgG+IgA+IgM) не был информативен AUC<0,6 Результаты ROC- анализа диагностической эффективности определения колоректального рака (программа MedCalc version 11.4.2.0), основанного на иммунофлуоресцентном выявлении антител к онкоассоциированным гликанам Чем больше площадь под ROC- кривой, тем выше диагностическая чувствительность метода. Обнаружена диагностическая сигнатура из антител к четырем онкоассоциированным гликанам (Set of four): Tn, TF, SiaLeA, and Manβ1-4GlcNAcβ . Маркер Антитела к четырем гликанам и 6 онкомаркеров 6 Онкомаркеров CEA и CA 19-9 "Oncology" model (CRC=1, IBD=0, HD=0) AUC 0.854 0.741 0.594 Se, % 48.5 27.3 21.2 Sp, % 95.8 97.9 100.0 PCCC, % 83.7 79.8 79.8 "Disease" model (CRC=1, IBD=1, HD=0) AUC 0.867 0.847 0.670 Se, % 66.7 66.7 48.3 Sp, % 91.3 92.8 87.0 PCCC, % 79.8 80.6 69.0 "CRC/IBD" model (CRC=1, IBD=0) AUC 0.902 0.793 0.684 Se, % 84.9 75.8 78.8 Sp, % 81.5 55.6 51.9 PCCC, % 83.3 66.7 66.7 "Oncology" model (CRC=1, IBD=0, HD=0); oncomarkers, glycans, and IgG+IgA+IgM AUC 0.962 0.841 0.761 Se, % 81.8 48.5 27.3 Sp, % 96.9 94.8 96.9 PCCC, % 93.0 83.0 79.1 "Disease" model (CRC=1, IBD=1, HD=0); oncomarkers, glycans, and IgG+IgA+IgM AUC 0.964 0.900 0.830 Se, % 83.3 71.7 68.3 Sp, % 89.9 91.3 82.6 PCCC, % 86.8 82.2 76.0 "CRC/IBD" model (CRC=1, IBD=0); oncomarkers, glycans, and IgG+IgA+IgM AUC 0.954 0.796 0.685 Se, % 90.9 75.8 72.7 Sp, % 88.9 59.3 51.9 PCCC, % 90.0 68.3 63.3 - Диагностическая сигнатура из шести онкомаркеров включает результаты определения концентрации: CEA, CA 19-9, CA 125, CA 15-3, HCG, и AFP; -Диагностическая сигнатура, состоящая из антител к четырем онкоассоциированным гликанам включает результаты определения антител к Tn, TF, SiaLe A , and Manβ1-4GlcNAcβ . -Чем больше площадь под ROC- кривой, тем выше диагностическая специфичность метода Результаты ROC- анализа диагностической эффективности определения колоректального рака, основанного на мультиплексном иммунофлуоресцентном выявлении антител к онкоассоциированным гликанам, определении уровня IgG IgA IgM и иммунофлуоресцентном выявлении онкомаркеров в сыворотках крови пациентов на биологических микрочипах Se- чувствительность метода % Sp- специфичность метода% PCCC- доля верно определенных диагнозов % ВЫВОД: Комбинирование сигнатур в единую, состоящую белковых онкомаркеров, антител к онкоассоциированным гликанам и уровня иммуноглобулинов (IgG+IgA+IgM), позволило достичь увеличения показателей PCCC = 93%, Se = 81%, Sp = 98% , по сравнению с PCCC = 79%, Se = 21%, and Sp = 100% для CEA и CA 19-9. Заключение • Одновременное использование белковой и гликановой сигнатуры позволяют выявлять колоректальный рак надежнее, чем обычно используемая пара онкомаркеров CEA+CA19.9. Комбинирование сигнатур в единую, состоящую белковых онкомаркеров, антител к онкоассоциированным гликанам и уровня иммуноглобулинов (IgG+IgA+IgM), позволило достичь увеличения показателей PCCC = 93%, Se = 88%, and Sp = 98% , по сравнению с PCCC = 80%, Se = 21%, and Sp = 100% для CEA and CA 19-9. • Биочиповый формат позволяет определять белковые маркеры и антитела одновременно, в процедуре, мало отличающейся от ELISA. • Возможна перспектива практического применения мультиплексного 3D чипа в диагностике колоректального рака и других онкологических заболеваний. Благодарность за сотрудничество: к.ф-м.н. В.Р. Чечеткину- разработка метода формирования сигнатуры д.м.н., проф. Ю.П. Резникову – ФГБУ ЦКБП Управделами Президента РФ д.х.н. , проф. Н.В. Бовину- ИБХ РАН к.х.н., Н.В. Шиловой д.м.н., проф. Г.А. Григорьевой – ММА им. И.М. Сеченова доктору Е.И. Пожарицкой– ФГБУ ГКБ №12 д.б.н., проф.П.Г. Свешникову – Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения (получение моноклональных антител) проф. А. А. Рагимову- Российского Научного Центра Хирургии имени академика Б.В. Петровского Российской Академии Медицинских Наук (предоставление образцов сыворотки крови от здоровых пациентов) Сотрудникам ИМБ РАН группа производства биологических микрочипов: О.В. Моисеевой, О.Г. Сомовой, О.А. Ивашкиной С.В. Панькову, Р.А. Юрасову, Д.А. Юрасову, Э.Я. Крейндлину и многим другим нашим коллегам, без которых было бы невозможно развитие данной тематики ! Представленная работа была поддержана Министерством образования и науки РФ, Соглашение о предоставлении субсидии № 14.604.21.0103 от 05 августа 2014 г., уникальный номер научного исследования RFMEFI60414X0103. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП- ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА ОНКОМАРКЕРОВ protein/Sach/DNA X R n protein Sach protein X = NH 2 , SH, R = COOH, CONH 2 R1 = CONH-CH 2 -NHCO Si (CH 2 ) 3 O C O C CH 2 CH 3 O O O R1 Схема производства биологического микрочипа ОНКОМАРКЕРЫ • Опухолевые маркеры- соединения (белки, БА пептиды, гормоны, ферменты, метаболиты), которые синтезируются раковыми клетками, либо клетками нормальных тканей в ответ на развитие рака. * Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомареры. Пособие для врачей Онкомаркер, принятое сокращение Концентрация в крови в норме Повышается при: Диапазон определения на биочипах Аналитическая чувствительнос ть на биочипах Альфа-фетопротеин (АФП) ≤ 10 нг/мл (у мужчин и небеременных женщин) Рак органов репродуктивносй системы, злокачественные опухоли молочной железы, бронхов, колоректальная карцинома, рак и метастазы печени 1-500 нг/мл 1 нг/мл Раково-эмбриональный антиген (РЭА) ≤ 5 нг/мл < 10 нг/мл (для курящих) Аденокарциномы кишечника, легких, молочной железы, C-клеточная карцинома щитовидной железы, карцинома ЖКТ, дыхательных путей, злокачественные образования соединительной ткани 0,5-200 нг/мл 0,5 нг/мл Хорионический гонадотропин (ХГЧ) ≤ 10 МЕ*/л (у мужчин и небеременных женщин) Рак легких, органов мочеполовой системы и желудочно-кишечного тракта, органов репродуктивной системы, хорионэпителиома, хорионкарцинома, карцинома яичка и плаценты, тератомы яичника и яичек 2-600 МЕ/мл 2 МЕ/мл Карбогидратный антиген 15-3 (СА 15-3) ≤ 28 МЕ/мл (у небеременных женщин) Карцинома молочной железы, опухоли яичников, шейки матки, цирроз печени 8-500 МЕ/мл 8 МЕ/мл Карбогидратный антиген 125 (СА 125) ≤ 35 МЕ/мл Рак яичников, сопутствующий маркер многих опухолей , опухоли ЖКТ, карцинома бронхов, молочной железы 6-600 МЕ/мл 6 МЕ/мл Карбогидратный антиген 19-9 (СА 19-9) ≤ 37 МЕ/мл Карцинома поджелудочной железы, кишечника, желудка, толстой кишки, панкреатит 7-700 МЕ/мл 7 МЕ/мл Простата-специфический антиген Общая форма (ПСАобщ) Свободная форма (ПСАсвоб) ≤ 4 нг/мл (мужчины до 50 лет) ПСА cвоб /ПСА общ > 0.15 Рак простаты 0,2-100 нг/мл 0,1-100 нг/мл 0,2 нг/мл 0,1 нг/мл Нейрон-специфическая енолаза (НСЕ) ≤ 12.5 нг/мл Мелкоклеточный рак легких, опухоли нейроэндокринного происхождения 3-200 нг/мл 2 нг/мл • Воспроизводимость : коэффициент вариации не более 15% Аналитические характеристики тест-системы 25 Калибровочная кривая в области низких концентраций Антиген, нг/мл Антиген, нг/мл Калибровочная кривая А Box-and-wiskers диаграмма. Распределение флуоресцентных сигналов полученных на гликочипах от ячеек, содержащих иммобилизованные антитела к иммуноглобулинам (IgG, IgA, IgM) человека: здоровые доноры (HD); пациенты с колоректальным раком (CRC); пациенты с синдромом раздражённого кишечника (IBD). Границами ящика служат 25-й и 75-й процентили соответственно, линия в середине ящика — медиана (50-й процентиль). Концы усов — края статистически значимой выборки (без выбросов). В Калибровочная кривая для иммуноглобулина G. Каждая точка калибровочной кривой есть среднее из десяти измерений. Пример флуоресцентного изображения гликочипа |