лекция. Лекция2. Репликация. Транскрипция. Трансляция._compressed (1). Зыкова Екатерина Владимировна Кафедра теоретической биохимии с курсом клинической биохимии план лекции
 Скачать 1.93 Mb.
|
Репликация ДНК, ферменты, участвующие в процессе у эукариот. Биосинтез белка и его регуляция. Генетический код. Этапы синтеза белка. Транскрипция, процессинг и сплайсинг синтеза белка. Трансляция. Пострансляционная модификация белка. Зыкова Екатерина Владимировна Кафедра теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ПЛАН ЛЕКЦИИ • Матричные процессы в клетке • Нуклеиновые кислоты • Репликация • Репарация • Транскрипция • Трансляция Матричный биосинтез – процесс синтеза (сборки) молекул биополимеров (нуклеиновых кислот и белков) в живых организмах, строение которых определяется матрицей. Процессы в организме, использующие принцип матричного синтеза Процесс Матрица Продукт Функции в организме Основной фермент Репликация ДНК (обе цепи) ДНК (новая цепь) Дублирование генетической информации при делении клеток ДНК-зависимая ДНК-полимераза Транскрипция ДНК (одна из цепей) РНК Начальная стадия реализации генетической информации ДНК-зависимая РНК-полимераза Трансляция мРНК Полипептид Формирование первичной структуры белков организма Пептидилтранс- фераза Репарация ДНК (одна из цепей) ДНК (вставка в поврежденной цепи) Восстановление поврежденной генетической информации ДНК-зависимая ДНК-полимераза Три обязательные стадии матричных биосинтезов Инициация – процесс, в котором образуется первая связь между мономерными звеньями синтезирующейся полимерной цепи. Элонгация - процесс поэтапного удлинения цепи растущего полимера. Терминация - процесс остановки роста синтезируемой полимерной цепи и отсоединение ее от матрицы. Нуклеиновые кислоты Биологические полимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. Нуклеиновые кислоты Обеспечивают формирование 2-х информационных потоков: ➢ Первый поток реализуется в период деления клетки (воспроизводится информация, заключенной в молекуле ДНК - инструкция о строении всех видов РНК и всех белков организма) ➢ Второй поток информации реализуется в процесс жизнедеятельности клетки (экспрессия генов приводит к синтезу спектра белков, необходимых в данном месте в данное время) В 1889 г Коссель - термин «нуклеиновые кислоты» Строение нуклеотидов 2. Пентоза – D(или β)-рибоза или D (или β)-2-дезоксирибоза 1. Пуриновое или пиримидиновое азотистое основание 3. Остатки фосфорной кислоты α β γ Дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ) – фосфорный эфир нуклеозида Первичная структура ДНК и РНК -это В молекулах нуклеиновых кислот остатки нуклеотидов соединены между собой 3’,5’-фосфодиэфирными связями. полинуклеотидная цепь, удерживаемая фосфодиэфирными и гликозидными связями Джеймс Уотсон и Френсис Крик 25 апреля 1953 года в американском журнале Nature была опубликована статья Джеймса Уотсона и Френсиса Крика «Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты». Публикация занимала чуть больше одной странички, в ней был всего один очень простой рисунок. Так, более 60 лет назад, впервые была предложена модель пространственной структуры ДНК, за которую ее авторы получили Нобелевскую премию. (Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids // Nature. 1953. V. 171. P. 738-740 Вторичная структура ДНК Две комплементарные, антипараллельно расположенные нуклеотидные цепи образуют правозакрученную спираль с общей осью Правила построения молекул ДНК 1 . Комплементарность (дополнительность) Каждому азотистому основанию одной цепи соответствует строго определенное азотистое основание другой цепи (А-Т; Г-Ц) 2.Антипараллельность ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, ориентированных антипараллельно ( 5 ’- конец одной из них расположен напротив 3’-конца другой С1’ С1’ С1’ С1’ Азотистые основания соединяются водородными связями Третичная структура ДНК Укладка молекулы ДНК в компактную структуру ХРОМОСОМУ (нуклео- протеидный комплекс) с помощью белков гистонов ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК Уровни структурной организации хроматина Обозначение Структура 1 Двойная спираль Собственно вторичная структура ДНК 2 Нить нуклеосом Цепь ДНК, через определенное расстояние намотанная на гистоновый октамер 3 Нуклеосомное волокно Плотная однорядная упаковка нуклеосом при участии гистона Н1 4 Соленоид Плотная трехрядная упаковка нуклеосом 5 Петли Спирализация соленоида, организующаяся при участии негистоновых белков хроматина и белков ядерного скелета 6 Мини-диски Структурное объединение примерно 20 петель 7 Хромосома Плотная стопчатая упаковка мини-дисков Ядерные белки богатые лизином и аргинином, содержат структурный мотив α-спираль-поворот-α-спираль. Гистоны Упаковка ДНК в хромосому с помощью белков Модификация Суть модификации Аминокислотные остатки-мишени Биологическая роль Фосфорилирование Присоединение остатков ортофосфорной кислоты Сер Стимулирует конденсацию хроматина Ацетилирование Присоединение остатка уксусной кислоты Лиз Стимулирует разворачивание хроматина Метилирование Присоединение СН 3 - группы Лиз Данные противоречивы Убиквитирование (только для Н2а) Ковалентное связывание с низкомолекулярным белком убихвитином Лиз Стимулирует разворачивание хроматина АДФ-рибозилирование Присоединение АДФ-рибозы ? Необходимо в процессе репарации ДНК Активность ферментов, ответственных за модификацию, регулируется и зависит от стадии клеточного цикла Химическая модификация гистонов Ацетилирование гистонов Репликация ДНК (replico - повторяю) процесс образования идентичных копий ДНК, осуществляемый комплексом ферментов и белков Репликация ДНК происходит при делении клеток и лежит в основе передачи наследственных признаков РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Принципы процесса репликации • комплементарность — новая цепь строится по принципу дополнения материнской цепи • полуконсервативность — одна цепь молекулы ДНК, образовавшейся в результате репликации, является вновь синтезированной, а вторая — материнской; • униполярность - идёт в направлении от 5’-конца новой молекулы к 3’-концу; • прерывистость — одна из цепей ДНК синтезируется непрерывно, а вторая — в виде набора отдельных коротких фрагментов ( фрагментов Оказаки ); • начинается с определённых участков ДНК , которые называются сайтами инициации репликации англ. Основные этапы репликации • Инициация • Элонгация • Терминация Репликация ДНК человека имеет очень большие размеры, скорость репликации - 50 нуклеотидов в минуту. На репликацию требовалось бы примерно 800 ч. Поэтому инициация синтеза ДНК происходит в нескольких точках хромосомы, которые называются точками инициации репликации, или ориджинами (origin) репликации. Ориджины репликации имеют определенную нуклеотидную последовательность. ИНИЦИАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ 1. Перед процессом репликации молекула ДНК должна быть раскручена (Фермент: ДНК-топоизомеразы ). 2. Две нити должны быть разделены (как две стороны молнии), путем разрыва слабых водородных связей между нуклеотидами ( Фермент : хеликаза ). 3. После того, как нити ДНК были разделены, они должны быть стабилизированы (SSB- белки ). 4. Образование праймера (Фермент: праймаза) .Синтез новой цепи ДНК требует затравки в виде небольшого фрагмента РНК, т.к. ведущий его фермент ДНК-полимераза для работы нуждается в свободной 3'OH группе. ДНК-топоизомеразы ДНК-топоизомераза I разрывает фосфоэфирную связь в одной из цепей двойной спирали и ковалентно присоединяется к 5'-концу в точке разрыва. После формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв в цепи и отделяется от ДНК Участвуют в инициации репликации и регуляции суперспирализации ДНК ХЕЛИКАЗА ДНК-хеликаза осуществляет разрыв водородных связей в двухцепочечной молекуле ДНК, использует энергию АТФ . СУПЕРСПИРАЛИЗАЦИЯ ДНК Топоизомеразы типа I • временно разрезают одну цепь ДНК из двух • 5’-фосфат разрезанной цепи ковалентно прикрепляется к Tyr фермента • Разорванная нить раскручивается, и цепь зашивается • Энергии извне не требуется Топоизомераза типа II: ДНК Стабилизируют разделенные одноцепочечные фрагменты SSB – белки single strand binding proteins Элонгация репликации ОСНОВНОЙ ФЕРМЕНТ Репликации - ДНК- ПОЛИМЕРАЗА Катализирует реакцию: Матрица - цепи ДНК Субстраты - нуклеотидтрифосфаты ( dАТФ, dГТФ, dТТФ, dЦТФ ), они же - источники энергии. Продукт – дочерние цепи ДНК Фермент ДНК-полимераза перемещается вдоль открытой нити ДНК, присоединяя вновь прибывшие нуклеотиды к новой нити ДНК, комплементарной к шаблону. Ферментативная реакция, катализируемая ДНК- полимеразой - присоединение нуклеотидмонофосфата к свободному 3-концу Особенность ДНК- полимераз Не могут начинать синтез ДНК , а способны только добавлять новые дезоксирибонуклеотиды к 3 ’-концу уже имеющейся полинуклеотидной цепи Эти ферменты нуждаются в затравке (праймере –фрагменте РНК), которая предоставляет свободный 3 ΄-гидроксильный конец для присоединения к нему дезоксирибонуклеотидов Асимметричный синтез ДНК в направлении 5’-→ 3’ Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с опережением относительно другой цепи. Первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Лидирующая цепь образуется в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запаздывающая цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов – фрагменты Оказаки. Размеры фрагментов Оказаки: фаги – 1000-2000 н, E.coli – 1000 н эукариоты – 200-400 н. ТЕРМИНАЦИЯ ЭТАПЫ ТЕРМИНАЦИИ 1. Вырезание праймеров (фермент полимераза) 2. Застраивание брешей, образовавшихся после вырезания праймеров дезоксирибонуклеотидами :на лидирующей цепи -1 праймер, на отстающей – праймер на каждом фрагменте Оказаки ( фермент полимераза) 3. Сшивание фрагментов ДНК (фермент лигаза) Репарация Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать повреждения , возникающие в ДНК спонтанно или в результате воздействия разнообразных повреждающих факторов. Повреждения ДНК и их причины • Ионизирующая радиация • УФ-излучение • Активные формы кислорода • Химические агенты • Спонтанные изменения Виды репарации • Прямая - обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения. • Эксцизионная – происходит в несколько этапов сопровождается вырезанием большого фрагмента цепи ДНК Репарация Пример: прямая репарация циклобутановых димеров Фотореактивация. Фермент фотолиаза активируется светом и расщепляет образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями (тиминами)и восстанавливает нативную структуру ДНК. Основные этапы 1. Узнавание повреждения (ДНК эндонуклеаза) 2. Разрез цепи ДНК ферментом по обе стороны от повреждения 3. Эксцизия (вырезание и удаление участка ДНК) 4. Восстановление структуры ДНК (ДНК – полимераза) 5. Сшивание концов ДНК (лигаза) Эксцизионная репарация Дефекты репарационных систем и наследственные болезни Синдром блума Изменения сосудов конъюнктивы при синдроме Луи-Бара. Пигментная ксеродермия (пятна, короста, рак кожи) – нарушение репарации УФ – повреждений (глубокие поражения капилляров на лице) – мутация ДНК-лигазы Матричные биосинтезы Транскрипция В каждом типе клеток экспрессируется свой набор генов и в определенный промежуток времени определенные гены Ген (ДНК ) Транскрипция мРНК Трансляция Белок РНК-полимераза ГЕН – единица транскрипции эукариот Структура гена ПРОМОТОР - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой ( место старта синтеза РНК ) ТЕРМИНАТОР - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой ( финиш транскрипции) ЭКЗОН – транскрибируемый и транслируемый участок гена эукариот ИНТРОН – транскрибируемый, но не транслируемый участок гена эукариот Транскрипция - это синтез всех видов РНК (мРНК, рРНК, tРНК) на матрице ДНК ферментом ДНК- зависимой РНК-полимеразой. 52 a a b ’ RPB3 RPB11 RPB2 RPB1 RPB6 РНК-полимераза - это белок с четвертичной структурой, состоящий из различных субъединиц prokaryotic eukaryotic b 53 “Crab claw” shape of RNAP (The shape of DNA pol is__) Активный центр Стадии транскрипции ИНИЦИАЦИЯ ЭЛОНГАЦИЯ ТЕРМИНАЦИЯ •Связывание РНК полимеразы с промотором ДНК •Расплетание ДНК на участке 10-20 нуклеотидов •Образование фосфодиэфирной связи между первыми рибонуклеотидами •Удлинение цепи РНК •Остановка синтеза РНК •Распад тройного комплекса: ДНК, РНК, полимераза У эукариот специализированные ядерные РНК- полимеразы трех типов • РНК-полимераза I - синтезирует rРНК (кроме 5S rРНК). • РНК-полимераза II - синтезирует mРНК и мяРНК. • РНК-полимераза III - синтезирует tРНК, и 5SrРНК Базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции. Базальные факторы транскрипции необходимы для инициации транскрипции всеми типами ядерных РНК-полимераз. Инициация транскрипции • В промоторе располагается находится ТАТА-бокс, максимально приближен к точке инициации транскрипции. • А на расстоянии -60-80 п.н. находится другой-бокс ( с переменным составом нуклеотидов) . • Расстояние между ТАТА –боксом и боксом с переменным составом нуклеотидов больше размера сигма-фактора РНК-полимеразы. • Каждый бокс опознается своим базальным фактором транскрипции • К этим белкам присоединяются другие базальные факторы транскрипции • К комплексу транскрипционных факторов присоединяется РНК-полимераза A TATAAA D Pol II РНК Один из факторов фосфорилирует РНК- полимеразу, она меняет конформацию, факторы остаются в зоне промотора, начинается транскрипция A B E TATAAA Pol II D F H Инициация СТРУКТУРА ТРАНСКРИПЦИОННОГО КОМПЛЕКСА ЭУКАРИОТ Транскрипционный комплекс очень сложеный, состоит из нескольких типов белков: Базальные факторы - определяющих стартовую точку Коактиваторы - связывающие базальные факторы с активаторами Активаторы - связывающиеся с регуляторными участками энхансерами Репрессоры - мешающие связыванию активаторов Элонгация Элонгация - удлинение цепи РНК с определенной скоростью (примерно 40-50 нукл./сек. ) Субстраты – НТФ (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ), они же источники энергии Терминация Видов терминации несколько, механизм терминации зависит от строения участка в конце гена - терминатора . Пример: Терминатор - ПАЛИНДРОМ ( участок с комплементарными основаниями) В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК- полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК – синтез заканчивается . Терминация • - фактор - это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. • - фактор способен узнавать 5`-конец синтезируемой РНК длиной приблизительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК- полимераза движется по ДНК. • В терминаторе много Г-Ц пар (с тремя водородными связями), РНК- полимераза замедляет ход, - фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается - зависимая терминация Процессинг первичных транскриптов ДНК пре-РНК РНК белок ДНК репликация, рекомбинация и репарация транскрипция процессинг трансляция свертыва- ние, сборка, процессинг Процессинг РНК – структурное и химическое изменение вновь синтезированных молекул РНК. Этап между транскрипцией и трансляцией Созревание рибосомальных РНК • Предшественником зрелых рРНК является одна молекула (пре-рРНК) • Данная молекула разрезается ферментами эндонуклеазами на индивидуальные цепи РНК • Индивидуальные цепи РНК в ядре связываются с белками, образуя большие и малые субъединицы рибосом, которые затем выходят в цитоплазму. Созревание транспортных РНК • Укладка в пространстве в форме клеверного листа • Формирование участка для связывания аминокислот (присоединение к 3’ концу тРНК трех нуклеотидов – C, C и А) • • Антикодон (участок из 3-х нуклеотидов) занимает положение (по центру центральной петли тРНК) exon 1 intron 1 exon 2 1. Кэпирование 5’-конца – его модификация с образованием метилированного гуанина. Это защищает транскрипт от деградации 5’- экзонуклеазами (благодаря 5’-5’ связи), необходимо для транспорта в цитоплазму и обеспечивает связывание мРНК с рибосомой в цитоплазме. 2. Полиаденилирование 3’-области : присоединение к растущей цепи РНК 100- 200 остатков адениловой кислоты. При этом формируется полиА- последовательность, которая замедляет гидролиз транскрипта в цитоплазме (определяет время жизни мРНК). 3. Сплайсинг (вырезание интронов и сшивание экзонов) Созревание мРНК проходит в три этапа exon 1 exon 2 Созревание эукариотических матричных РНК Кэпирование 5’ конца – образование участка из нескольких модифицированных нуклеотидов. • Первый нуклеотид всегда 7- метилгуанилат, соединенный с очередным нуклеотидом пирофосфатной связью. • Несколько следующих нуклеотидов метилируются по 2 положению рибозы Сплайсинг проходит в специальной внутриядерной структуре – сплайсосоме, которая состоит из 6 типов малых ядерных РНК (snRNps) и множества белков. Нарушение процесса сплайсинга: - фенилкетонурия: нарушенный сплайсинг 12-го и 13-го экзонов гена Phe- гидроксилазы - талассемия: мутации, нарушающие сплайсинг бета-глобиновых генов (и другие мутации этих генов). Трансляция Матричные биосинтезы Синтез полипептидной цепи Трансляция – циклический процесс в котором свободные аминокислоты объединяются в генетически запрограмированную последовательность, образуя полипептид. Компоненты белок синтезирующей системы • Аминокислоты • мРНК • тРНК • Рибосомы (малая и большая субъединицы субъединиц на этапе трансляции собираются в единую молекулу -рибосому ) • Белковые факторы Центры рибосом • Р-центр - пептидильный При инициации в нем находится транспротная РНК с метионином, при элонгации транспортная РНК с растущей цепью пептида • А-центр - аминоацильный На этапе элонгации в нем находится транспортная РНК с новой аминокислотой или растущей цепью пептида • К-центр - каталитический (пептидилтрансферазный) Обеспечивает формирование пептидной связи в растущей цепи пептида Для всех живых организмов характерна единая система записи генетической информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов – она называется генетический код Последовательность нуклеотидов в ДНК кодирует последовательность аминокислот в белках Свойства генетического кода Триплетность - одну аминокислоту кодируют три нуклеотида (кодон). Исключения: УAA, УAГ, УГA не кодируют ни одну из аминокислот (терминирующие или стоп- кодоны). Вырожденность – большинство число аминокислот кодируется несколькими кодонами Универсальность – одинаковое кодирование аминокислот вне зависимости от уровня организации объекта Непрерывность - отсутствие сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого нуклеотида …АТАГЦЦЦГАТГТАГ… Нобелевская премия 1968 Роберт Вильям Холли (США) Хар Гобин Корана (США) Маршал Уорен Ниренберг (США) за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков В 1970 ученым удалось синтезировать ДНК, а спустя несколько лет ген кишечной палочки СТАДИИ ТРАНСЛЯЦИИ Инициация Образование инициаторного комплекса 1. мРНК связывается с малой субъединицей рибосомы, инициирующий кодон (AUG, кодирующий метионин) устанавливается в Р- центре 2. Инициирующая тРНК (несущая метионин) связывается с инициирующим кодоном 3. Большая субъединица соединяется с малой субъединицей Активация аминокислот Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи специфических ферментов аминоацил- тРНК-синтетаз в присутствии АТФ. Процесс протекает в две стадии: Каждая аа-тРНК-синтетаза катализирует реакцию специфического связывания одной из 20 аминокислот с соответствующей тРНК • eukaryotic mRNA lac I P O lac Z lac Y lac A AUG AUG AUG AUG SD AUG SD AUG Инициаторный кодон с последовательностью SD внутренний кодон Met 5’ 5’ кэп AUG сканирование от 5’-кэпа до первого кодона AUG AUG AUG Инициаторный кодон с последовательностью SD внутренний кодон Met Два пути поиска стартовой точки трансляции В мРНК прокариот – внутренняя инициация: триплет AUG (GUG, UUG) через 3-8 остатков после GGAG-содержащей последовательности Шайна-Дальгарно длиной 4 -7 н. В мРНК эукариот – терминальная инициация по сканирующему механизму: определяется первый от 5’-кэпа триплет AUG в контексте A/G CCAUG G A/CU: Инициация Образование инициаторного комплекса у прокариот 1. мРНК связывается с малой субъединицей рибосомы, инициирующий кодон устанавливается в Р-центре 2. Инициирующая тРНК (несущая формилметионин) связывается с инициирующим кодоном 3. Большая субъединица соединяется с малой субъединицей – образуется инициаторный комплекс IF-3 –препятствует преждевременному связыванию субъединиц рибосом IF- 2+ГТФ-участвуют в связывании инициирующей тРНК IF-1- способствует новой «зарядке» еIF- 2 (присоединяя к нему очередную молекулу ГТФ и инициирующую тРНК) Элонгация В Р - центре находится транспортная РНК с метионином В А – центре присоединяется транспортная РНК с аминокислотой антикодон которой совпадает со вторым кодоном на мРНК Элонгация (1-ый цикл) Пептидилтрансфераза переносит метионин из Р- центра в А-центр Образуется пептидная связь между метионином (С=О группа) и аминокислотой (NH группа), находящейся в А- центре Транспептидация (образование пептидной связи) Элонгация • Рибосома сдвигается на один кодон ( транслокация – энергозависимый процесс) • Транспортная РНК к которой был присоединен метионин покидает рибосому. • Второй кодон с прикрепленной к нему транспортной РНК с дипептидом оказывается в Р- центра. • В А-центр попадает третий кодон и к нему присоединяется очередная транспортная РНК с соответствующим антикодоном и новой аминокислотой • Повторяется 1-ый цикл Элонгация Элонгация продолжается до тех пор, пока в А-центр не попадает один из терминирующих (стоп) кодонов Пептидилтрансфераза катализирует перенос молекулы пептида не на очередную аминокислоту, а на молекулу воды, вызывая гидролиз и распад трансляционного комплекса (пептид, тРНК, мРНК, субъединицы рибосом) Терминация мРНК в процессе трансляции в составе полисомы Трансляция мРНК прокариот Трансляция мРНК эукариот Трансляция может начинаться еще до полного завершения транскрипции Транскрипция и трансляция разобщены в пространстве (ядро и цитоплазма) и времени (не менее 10 мин). мРНК в процессе трансляции в составе полисомы Пространственная сборка белка (фолдинг) Фолдинг – сворачивание пептидной цепи в правильную трехмерную структуру Возможная последовательность фолдинга белка СЛУЧАЙНЫЙ КЛУБОК нет ни вторичной, ни третичной структуры, пептидная цепь развернута СОСТОЯНИЕ- ПРЕДШЕСТВЕННИК РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ вторичная структура сформирована не до конца, третичная структура отсутствует, цепь частично развернута РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА вторичная структура сформирована, цепь полностью свернута в компактную глобулу, но жесткая третичная структура отсутствует НАТИВНЫЙ БЕЛОК цепь свернута в компактную глобулу, которая имеет определенную третичную структуру Стадии самопроизвольного сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию in vitro «Расплавленная глобула» Нативная структура белка Полипептидная цепь Факторы фолдинга Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания белков (ферменты фолдинга, или фолдазы ) 1. Протеинсульфоизомераза 2. Пептидилпролилизомераза Молекулярные шапероны, участвующие в пространственной укладке белков Большая группа неродственных белковых семейств Протеиндисульфидизомераза (PDI) (способствует сворачиванию секретируемых клетками белков, содержащих дисульфидные мостики (инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобулины) Катализирует изомеризацию дисульфидных связей в формирующемся белке, дает ему возможность найти (путем случайного перебора) такую комбинацию этих связей, которая соответствует энергетически наиболее оптимальной пространственной структуре. Пептидил-пролил-цис/транс-изомераза (PPI) Катализирует переход радикалов в области пептидной связи Pro из транс-конфигурации в цис-конфигурацию и обратно. Обеспечивает возможность пептидной связи делать в области нахождения аминокислоты пролина, такие изгибы, которые приводят к наиболее оптимальной пространственной структуре Пространственная сборка белков in vivo осуществляется с помощью шаперонов • Молекулярные шапероны – большая группа неродственных белковых семейств, которые – участвуют в стабилизации развернутых или частично свернутых белков; – способствуют корректному фолдингу белков и сборке белковых комплексов • Нуклеоплазмин – первый «молекулярный шаперон» участвует в сборке нуклеосом Структура нуклеоплазмина Свойства молекулярных шаперонов • Участвуют в сборке белков и белковых комплексов (вновь синтезированных), но не входят в конечный продукт; • Есть во всех компартментах клетки, где происходит сборка белков; • Большинство шаперонов - АТФ-зависимые; • Защищают белки от нежелательных процессов, в том числе от агрегации; • Участвуют в некоторых видах внутриклеточного транспорта, предупреждая преждевременный фолдинг (митохондрии); • Могут осущестлять рефолдинг (многие шапероны являются белками теплового шока (heat shock proteins, Hsp); • Поддерживают ряд белков в определенной конформации, в состоянии незавершенного фолдинга (рецептор к глюкокортикоидным гормонам Как работают шапероны при фолдинге белков? • Связывают и стабилизируют полипептиды, имеющие ненативную конформацию, взаимодействуя с гидрофобными областями молекул; • Предоставляют возможность полипептидам, имеющим ненативную конформацию, правильно свернуться в изолированном гидрофобном окружении. Классификация шаперонов (HSP) Сем-во Шапероны Роль Hsp10 GroES, Gp31, Hsp10, Cpn10 Фолдинг белков, кошапероы для Hsp60 Hsp60 GroEL, TF55, Hsp60, TriС Фолдинг белков Hsp70 DnaK, Hsc/Hsp70, Bi Р, Hsp68, 70, 71, 73 Стабилизация развернутых белков, фолдинг белков, трнслокация через мембраны, защита от стресса Hsp90 Hsp90, Grp94, ERp90, HtpG Предотвращение агрегации белков, регуляция активности рецепторов стероидных гормонов и киназ. Hsp100 Hsp104, C1pA, B, X, Y Предотвращение агрегации белков, содействие в протеолизе белков Hsp40 DnaJ, Hsp40, GrpE, HscB Стабилизация и фолдинг белков, кошапероы для Hsp70 Шапероны, относящиеся к различным семействам образуют шаперониновые системы Локализация Шапероны Роль Цитозоль прокариот GroEL/ GroES семейство: ( Нsp60/Hsp10) Фолдинг белков; необходим для сборки фагов Митохондрии эукариот Hsp60/Hsp10 семейство: ( Нsp60/Hsp10) Фолдинг белков Схема фолдинга вновь синтезированных белков в бактериальной клетке • Фолдинг белков начинается до окончания трансляции при участии шаперонов . Возможно несколько циклов укладки белка в нативную структуру • Если после этого белок продолжает находиться в состоянии незавершенного фолдинга (в виде расплавленной глобулы) • Завершение фолдинга таких белков происходит при участии шаперониновой системы Структура комплекса GroEL/GroES (E=E.coli) GroEL (L=Large) Состоит из двух семичленных колец, лежащих одно под другим, 14 идентичных субъединиц (57kD); GroES (S=Small) Состоит из одного семичленного кольца, 7 идентичных субъединиц (10kD) Структура субъединицы GroEL Субъединица GroEL cостоит из трех доменов: • Экваториальный домен - образует контактs с аналогичным доменом на втором кольце; - связывает АТФ; • Промежуточный домен - является гибким шарниром, обеспечивает связывание АТФ и GroES • Апикальный домен – cвязывает полипептид; сайт связывания содержит в основном крупные гидрофобные ак, – cвязывает GroES. Конформационные изменения в шаперонине GroEL При связывании АТФ и GroES: • увеличивает объем внутренней полости примерно в 2 раза; • меняет расположение гидрофобных остатков апикального домена, и внутренняя поверхность полости становится гидрофильной Схема фолдинга белковой молекулы при помощи шаперониновой системы GroEL/ GroES с • В открытый «котел» GroEL проникает белок в состоянии незавершенного фолдинга • Происходит связывание белка, имеющего на своей поверхности гидрофобные радикалы с и внутренней стенкой «котла» за счет избытка на ней гидрофобных радикалов • Происходит связывание крышечки GroES с «котлом». Поверхность «котла» становится гидрофильной. Идет фолдинг. • Через 15 секунд происходит гидролиз АТФ. Крышечка диссоциирует, «котел» становится гидрофобным Последствия: 1. Фолдинг завершен-молекула покидает систему 2. Фолдинг не завершен, белковая молекула вновь связывается со стенками «котла» цикл повторяется пока не будет достигнут необходимый результат Участие разных белков теплового шока в правильном сворачивании полипептидных цепей у E.coli (слева) и у эукариот (справа) Прионы как антишапероны • Не всегда результат фолдинга – это «правильная» полипептидная цепь. • Прионовый белок – белок мозга, находится в нормальной конформации (функция пока не выяснена). • при ряде заболеваний этот белок переходит в другие конформации (много участков с β-структурой, способной к агрегации). • Такой неправильный белок называют «прион» Прионы Прионы— особый класс инфекционных агентов, представленных белками с аномальной третичной структурой и не содержащих нуклеиновых кислот. Это положение лежит в основе прионной гипотезы Прионные болезни — группа нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся прогрессирующим поражением головного мозга и летальным исходом Прионные белки. Основной компонент прионов - аномальная изоформа прионного белка (одного из белков ЦНС ). Проникновение прионов в клетку приводит к нарушению конформации синтезируемого клеткой прионного белка , нарушению функции клетки и дальнейшему накоплению прионов. Причины появления прионов: 1. Ошибки фолдинга (редко) 2. Мутации гена, кодирующего прионный белок 3. Употребление в пищу тканей животных, в которых содержаться прионы Прионы Все известные прионы вызывают формирование амилоидов — белковых агрегатов, включающих плотно упакованные β-слои. Амилоиды представляют собой фибриллы, растущие на концах, а разлом фибриллы приводит к появлению четырёх растущих концов. Инкубационный период прионного заболевания определяется скоростью экспоненциального роста количества прионов, а она, в свою очередь, зависит от скорости линейного роста и фрагментации агрегатов (фибрилл). Для размножения приона необходимо исходное наличие нормально уложенного клеточного прионного белка; организмы, у которых отсутствует нормальная форма прионного белка, не страдают прионными заболеваниями. Устойчивость Прионная форма белка чрезвычайно стабильна и накапливается в поражённой ткани, вызывая её повреждение и, в конечном счёте, отмирание. Стабильность прионной формы означает, что прионы устойчивы к денатурации под действием химических и физических агентов, поэтому уничтожить эти частицы или сдержать их рост тяжело. Прионы существуют в нескольких формах — штаммах, каждый со слегка отличной структурой. Прионы вызывают некоторые дегенеративные заболевания ЦНС - болезнь Крейтцфельдта-Якоба , куру (туземцы Новой гвинеи) Предполагают также участие прионов в передаче человеку губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (коровьего бешенства) Прионы – уникальный природный инфекционный агент (лишен нуклеиновой кислоты) КЛАССИФИКАЦИЯ ПРИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ • Куру; • Болезнь Крейтцфельда-Якоба (спорадическая, ятрогенная, наследственная, новый вариант); • Синдром Герстмана-Штреусслера- Шайнкера; • Фатальная семейная бессоница Посттрансляционная модификация белков Особенности реакций посттрансляционной модификации • Катализируются специфическими ферментами (хотя есть и внутримолекулярные превращения • Модификации затрагивают определенные АК остатки • Могут происходить как во время синтеза полипептидной цепи (котрансляционная модификация), так и после окончания синтеза • Нематричные процессы, отсюда – образование множественных форм белка • Некоторые реакции характерны для очень многих белков, а некоторые для ограниченной группы или отдельных белков • Функциональная направленнность реакций посттрансляционной модификации (в отличии от повреждающих реакций) Функциональное значение посттрансляционной модификации 1. Увеличенивают разнообразие белковых молекул (структурное и функциональное); (Протеом человека состоит из 300000 различных белков, что почти в 10 раз превышает число генов) Обеспечивают: 1. Правильную сборку белков; 2. Регуляцию активности белков; 3. Передачу сигнала и др. Модификация внутренних аминокислотных остатков белков (I) Образование оксипролина (котрансляционно) • Часто встречается в коллагене, эластине; Образование оксилизина (котрансляционно) • Часто встречается в коллагене; Модификация внутренних аминокислотных остатков белков (II) Образование γ-карбоксиглутаминовой кислоты в белках, образующих комплексы с ионами Cа 2+ : протромбин, остеокальцин. Иодирование остатков Tyr в тиреоглобулине, идущем на синтез тиреоидных гормонов Модификации N-конца белков • Удаление N-формильной группы Met (прокариоты); • Отщепление инициирующего Met (эукариоты) Примерно у 50% цитозольных белков сохраняется Met. - Ацетилирование N-конца (около 50 % цитозольных белков ацетилировано); • Метилирование N-конца (редкая модификация, например рибосомные белки ). Ацетилированый N-конец белка Гликозилирование белков Гликопротеинами называют белки, содержащие ковалентно связанный углеводный компонент. Гликозилирование: – Одна из основных форм модификации белков (более 80% белков гликозилировано); – Происходит в основном в ЭПР и аппарате Гольджи (большинство секреторных и мембранных белков гликозилированно); – Реже происходит в цитоплазме и ядре; N- гликопротеины • Углеводный компонент присоединяется N-гликозидной связью к амидному азоту Asp • Происходит в ЭПР • Фолдинг белков препятствует N- гликозилированию O- гликопротеины • Углеводный компонент присоединяется О-гликозидной связью к оксигруппе Ser или Thr • Происходит в аппарате Гольджи; • О-гликозилирование может происходить после формирования глобулы; • О-гликозилирование встречается реже в глобулярных белках, чем N- гликозилирование. Функциональное значение гликозилирования • Стабилизация структуры белков, защита от протеаз (особенно для секреторных белков) • Передача сигнала – клеточные рецепторы в основном –гликопротеины и протеогликаны Фосфорилирование белков • Одна из наиболее общих модификаций белков эукариот; • В большинстве случаев фосфорилирование существует как механизм регуляции биологической активности белков (обратимо); • Перенос концевого фосфата АТФ (серин/треониновые киназы и тирозинкиназы) на гидроксильные группы Ser, Thr, Tyr; • Уровень фосфорилирования Ser, Thr, Tyr – 1000/100/1 Ограниченный протеолиз Ограниченный протеолиз –процесс протеолитического расщепления белков, приводящий к их активации. Формирование структуры инсулина • Препроинсулин (105 ак)→ • Проинсулин (86 ак) – вырезание С-пептида: • Инсулин – 21ак (А цепь) и 30ак (В цепь) Активация предшественников ферментов • Трипсиноген Активационный пептид Трипсин Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys -|-Ile-Val-Gly- Расщепление трипсином или энтеропептидазой (в 1000 раз эффективнее) Трипсиноген Трипсин • Многие ферменты синтезируются в виде неактивных предшественников – проферментов. • Во многих случаях активация – протеолитическое отщепление активационного пептида (панкреатические сериновые протеиназы – трипсин и хемотрипсин); Активация химотрипсиногена • Разрыв связи Arg15- Ile16; • Пептид остается связанным с ферментом дисульфидной связью; • Взаимодействие Ile16 с Asp184; • Удаление дипептида Ser14Arg15; • Разрыв связи Asn148- Ala149; • Удаление дипептида Thr147Asn148. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ Строение РНК -полимеразы a b b a ' Белок с четвертичной структурой Две a субъединицы - каркас РНК-полимеразы. b ′ - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет содержания большого количества положительно заряженных аминокислот. В b - субъединице находится каталитический центр, отвечающий за связывание между собой рибонуклеотидов (сигма) – фактор, который через базальные факторы транскипции связывает РНК –полимеразу с промотором Инициация транскрипции Направление транскрипции Старт транскрипции Промотор Строение промотора Промотор имеет консервативную после- довательность нукле- отидов - ТАТААТ (ТАТА- бокс) и переменную последовательность нуклеотидов Если структура промотора соответствует структуре сигма – фактора РНК –полимеразы – происходит инициация транскрипции Синтез белков на экспорт Почему лак-оперон не транскрибируется (молчит) если в среде есть одновременно глюкоза и лактоза Почему в эти условия не работает индуктор – лактоза Почему транскрипция начинается только того, как израсходуется вся глюкоза |
b) АТР связывается с положительной кооперативностью в цис-кольце и отрицательной кооперативностью в транскольце. с) Быстрое связывание GroES и связывание гидрофобных участков субстрата внутри камеры. d) Гидролиз АТР и сворачивание субстрата. e) Связывание АТР в противоположном кольце инициирует диссоциацию GroES и освобождение субстрата. f) Связывание новой молекулы субстрата и повторение цикла