ШПОРА ПО ГЕНЕТИКЕ. генетика 18.11. 1. Прогамный до оплодотворения. Соотношение половых хромосом при этом роли не играет, т к. ооциты диплоидны. (Некоторые черви, коловратки из крупных ооцитов развиваются самки, из мелких самцы). Сингамный
 Скачать 142.75 Kb.
|
|
1. Типы хромосомного определения пола 1. Прогамный - до оплодотворения. Соотношение половых хромосом при этом роли не играет, т.к. ооциты диплоидны. (Некоторые черви, коловратки - из крупных ооцитов развиваются самки, из мелких - самцы). 2. Сингамный- генетическое определение пола при оплодотворении, которое зависит от характера сочетания половых хромосом либо от соотношения половых хромосом и аутосом. 3. Эпигамный - под влиянием внешней среды (червь бонелия). К сингамному типу определения относится хромосомное определение пола с генетическим контролем. Ответственные за пол хромосомы назвали половыми. Нормальная мужская гамета несет либо Х, либо Y хромосому, а все яйцеклетки - Х-хромосому. В случае нормального расхождения хромосом при мейозе образуются нормальные яйцеклетки и сперматозоиды с обычным набором хромосом Х и Y. Пол зиготы определяется при соотношении гамет ХХ и ХY (гомогаметный и гетерогаметный). Хромосомная теория пола Корренса (1907) заключается в том, что пол определяется сочетанием половых хромосом при оплодотворении. Различают следующие типы хромосомного определения пола: ХY, ХО, ZW, ZO. При нарушении течения митоза или мейоза могут образовываться особи-гинандоморфы. Содержание половых хромосом в разных клетках таких особей может быть разное (мозаичность). У человека ХХ и XY, в связи с чем разные части тела могут иметь соответствующие признаки пола. Могут быть и другие случаи мозаицизма: ХХ/ХХХ, XY/XXX; XO/XXY и др. При нерасхождении половых хромосом возможных комбинаций половых хромосом в зиготах человека может быть 12, что является причиной хромосомных аббераций у человека. В случае нерасхождения половых хромосом при мейозе образуются гаметы ХХ и О у самок. и ХY и О у самцов. При участии их в оплодотворении формируются зиготы с необычным сочетанием половых хромосом. У человека такие аномалии встречаются 1 на 600-700 новорожденных. Зигота YО погибает на ранней стадии; особи ХХХ, ХХY, ХО - жизнеспособны и пол их зависит от наличия или отсутствия "Y" хромосомы, которая при любом количестве Х-хромосом контролирует формирование признаков мужского пола, развитие и стимулирует формирование семенников. Избыток Х-хромосом вызывает конституциональные аномалии и дефекты интеллекта. Но в природе встречаются особи, у которых "Y" хромосома генетически инертна и не оказывает особого влияния на определение пола. Балансовая теория пола (Бриджес, 1922). Изучено соотношение половых и аутосом У нормальных самок с набором хромосом 2п соотношение аутосом и Х-хромосом равно 1: 2п=2А+2Х (2Х: 2А=1 - нормальная самка), 1, 5 - сверх самки: 2А+3Х (3Х: 2А=1, 5 -бесплодна). У самцов соотношение составляет 0, 5 2п=2А+ХY (Х: 2А=0, 5). С уменьшением его особи остаются самцами 3А+ХY (Х: 3А=0, 33 - бесплоден) - сверхсамец. Значение коэффициента между 1 и 0, 5 соответствует фенотипу особей промежуточных по полу _интерсекс .: 3А+2Х(2Х: 3А=0, 66 - признаки обоих полов, бесплодны). Т.е., суть балансовой теории в том, что в определении пола принимают участие не только половые хромосомы, но и аутосомы. Один гаплоидный набор аутосом сообщает особи свойства мужского пола. В данном случае пол определяется соотношением количества (балансом) аутосом и половых хромосом. Пол организмов, совокупность морфологических и физиологических особенностей организма, обеспечивающих половое размножение, сущность которого сводится в конечном итоге к оплодотворению. При этом мужские и женские половые клетки — гаметы сливаются в зиготу, из которой развивается новый организм. В зиготе объединяются 2 гаплоидных (одинарных) набора хромосом материнской и отцовской гамет. В половых клетках нового организма образуются гаплоидные наборы уже перекомбинированных отцовских и материнских хромосом (в результате обмена участками гомологичных родительских хромосом — кроссинговера — и случайного их расхождения по дочерним клеткам во время мейоза). Поэтому в обоеполой популяции постоянно возникает множество генетически разных особей, что создаёт благоприятные условия для естественного отбора более приспособленных форм. В этом заключается основное преимущество полового размножения перед бесполым. У многоклеточных диплоидных организмов возникли специальные гаплоидные половые клетки: крупные и малоподвижные или неподвижные у женского пола, мелкие и обычно подвижные — у мужского. Помимо продуцирования клеток различного пола, самцы и самки различаются рядом морфологических и физиологических признаков, а также половым поведением, которые обеспечивают слияние половых клеток. 2. Половые хромосомы человека Половые хромосомы, в хромосомном наборе клеток раздельнополых организмов специальная пара хромосом, в которых локализованы гены, определяющие пол. Обычно партнёры этой пары разной величины: более крупный содержит факторы женского пола и называется Х-хромосомой, меньший называется Y-хромосомой. Факторы, определяющие мужской пол, могут быть локализованы в Y-хромосоме (у млекопитающих и человека). Обычно у самки имеются 2 одинаковые половые хромосомы (тип XX), а у самца или 2 неодинаковые (тип XY), или одна половая хромосома (тип Х0). Т. к. в клетках самки имеются две Х-хромосомы, то в результате мейоза все яйца содержат по одной Х-хромосоме (гомогаметный пол). У самцов же с XY-хромосомами образуются спермии двух типов: в одних Х-хромосома, в др. Y-хромосома (гетерогаметный пол). Случайное соединение половых клеток (гамет) в процессе оплодотворения приводит (в масштабе больших чисел) к появлению равного количества самок (XX) и самцов (XY). Кроме генов, определяющих пол, в половых хромосомах локализованы гены (в Х-хромосоме их много, в Y-хромосоме немного), определяющие различные признаки, которые называются сцепленными с полом, т.к. их наследование связано с наследованием пола. Отклонения от нормального числа половых клеток в клетках человека приводят к нарушениям развития, среди которых известны синдром Шерешевского — Тернера (Х0) у женщин (малый рост, бесплодие, умственная отсталость), синдром Клайнфелтера (XXY) у мужчин [высокий рост, длинные конечности, нарушения развития признаков пола, бесплодие, умственная отсталость; число Х-хромосом при этом синдроме может достигать 4 (XXXXY)], а также синдром трисомии Х-хромосом (XXX) у женщин, проявляющийся в нарушении психики и в недоразвитии яичников. Y-хромосома легко выявляется в клетках благодаря избирательной окраске её части флюоресцирующими красителями акрихиновой природы, что используется в целях диагностики. 3. Признаки контролируемые, ограниченные и связанные с полом Признаки, зависимые от пола Это признаки, гены которых расположены в аутосомах, а их проявление зависит от половых гормонов. А) Признаки, ограниченные полом – проявляются лишь у одного пола - рост молочных желез - лактация - оволосение лиц Б) Признаки, контролируемые полом проявляются у обоих полов, но в разной степени. - Алопеция – у мужчин в гетерозиготном состоянии (AA”XY), у женщин – только в гомозиготном (A”A”XX) - Тип голоса (бас, баритон, тенор, сопрано, меццо-сопрано, альт) Рассмотрим наследование признаков, сцепленных с полом, на примере гемофилии: в Х-хромосоме может находиться доминантный ген (H), отвечающий за нормальную свёртываемость крови, или рецессивный (h), отвечающий за гемофилию; если женщина гетерозиготна (XHXh), но гемофилия у неё не проявляется, но она является носителем болезни, т.к. содержит рецессивный ген; мужчина, несущий только одну Х-хромосому, может содержать только один из вариантов генов – H или h, поэтому даже при наличии рецессивного гена мужчина заболевает гемофилией (ген свёртываемости отсутствует). 4. Формирование пола у человека Хромосомный. Формируется во время оплодотворения. Половые клетки человека, гаметы, несут только 1 половую хромосому. Женские, яйцеклетки, всегда только хромосому Х, так как женский генотип ХХ, а мужские, сперматозоиды, либо Х либо У, так как мужской генотип ХУ. Таким образом, формирование хромосомного пола у человека зависит от того, какую хромосому передаст отец. Естественно, процесс этот спонтанный и от желания будущих родителей не зависит. Затем, параллельно, по мере роста и созревания эмбриона, начинаются другие этапы Гонадный, то есть формирование половых желез. Дело в том, что до определенного этапа первичные гонады эмбриона не дифференцированы по полу. Но в один прекрасный момент эмбриончики-мальчики, то есть те, у кого есть хромосома У, начинают активно «работать» специальным белком, в результате чего зачаточные гонады развиваются в семенники. А эмбриончики-девочки, те, у кого ХХ, такого белка не имеют, и их первичные гонады развиваются в яичники. Дальше свою работу начинает эндокринная система и начинается соматический этап, то есть дифференцировка тканей и органов, формирование внутренних и наружных гениталий. Еще нейробиологи говорят о нейронном этапе половой дифференцировки, то есть о формировании ЦНС по мужскому или женскому типу. Вот в таком сложном мире и живет будущий человечек в маме все 9 месяцев. Когда ребенок рождается, он получает паспортный пол в зависимости от строения наружных половых органов. И далеко не всегда этот пол совпадает с хромосомным! Но и это еще не все! Дальше, по мере роста и развития, у человечка происходит понимание собственной принадлежности к определенному полу, то есть идет социальный этап формирования пола. 1. Этапы ПЦР (выделение ДНК, амплификация, детекция) 1) Выделение ДНК - это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом, удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК. Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно. Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5-2 часа. 2) Амплификация ДНК. Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики - амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции). В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК - репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК. Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла - 4, после третьего - 8, после четвертого - 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати - на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии - снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция. Путем присоединения к цепи ДНК праймеров - искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) - образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК. Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка - ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК. Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности. Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование - ПЦР - термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов. 3) В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать - отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале. 3. ПЦР в реальном времени по сравнению с детекцией в помощью электрофореза. Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции. Данная методика в течение последних пяти лет успешно применяется в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира и в ближайшее время станет так же широко распространена, как и ПЦР в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК. Использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. 4. Преимущества и недостатки метода ПЦР Метод ПЦР (в диагностике инфекционных заболеваний) обладает следующими преимуществами: 1) Прямое определение. Многие традиционные методы лабораторной диагностики подразумевают выявление возбудителей заболевания по различным косвенным признакам. Например, ИФА-диагностика основана на обнаружении в крови пациента белков, являющихся продуктами распада инфекционных возбудителей, на основании чего врач может поставить тот или иной диагноз. Метод ПЦР-анализа дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического участка ДНК возбудителя. 2) Высокая специфичность ПЦР-диагностики. В процессе проведения анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный, т. е. присущий только конкретному возбудителю. 3) Высокая чувствительность ПЦР. Обнаружение инфекции возможно даже в том случае, если в забранном у пациента материале содержится лишь одна клетка. По сравнению с другими иммунологическими и микробиологическими методами диагностики: чувствительность ПЦР-анализа — 10—100 клеток в пробе, другие методы - 103—105 клеток. 4) Универсальность ПЦР-анализа. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток - поскольку инфекция может содержаться в любых биологических выделениях и тканях. 5) Высокая скорость получения результата ПЦР-анализа. Единый для всех метод обработки забранного на анализ у пациента материала, детекции продуктов реакции, автоматизированная ПЦР-амплификация позволяются провести полную ПЦР-диагностику за 4—5 часов.. 6) Возможность диагностики любого вида инфекции. Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет диагностировать инфекцию не только на острой стадии заболевания, но и хронические инфекции и даже наличие единичных бактерий или вирусов. Говоря о несомненном прогрессивном значении метода ПЦР и его неоспоримых преимуществах, вместе с тем, следует знать и об определенных недостатках этого метода и проблемах его проведения. 1) Ключевым фактором успешности процесса, является, пожалуй, правильный выбор последовательности праймеров. Можно использовать программы, значительно упрощающие поиск подходящих регионов ДНК или даже выбирающие пару праймеров автоматически. Однако ни один из существующих алгоритмов не обеспечивает полной гарантии хорошей работы праймеров. К тому же на самом деле они представляют собой смесь молекул различной длины и состава, что приводит к появлению «минусовых» фракций - молекул с последовательностью, укороченной на одно или несколько оснований, при этом положение пропущенного нуклеотида может быть любым. Поэтому для получения наилучших результатов следует проводить очистку от этих фракций. 2) Следует также обратить внимание на приготовление смеси четырех типов нуклеотидов. Неравная их концентрация ведет к существенному увеличению ошибок ДНК-полимеразы в ходе амплификации. Необходимо также поддерживать соответствующую концентрацию ионов магния, поскольку снижение концентрации свободных катионов влияет на температуру и специфичность гибридизации праймеров. 3.Чрезвычайная чувствительность метода требует строгого соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории, поскольку существует риск амплификации очень небольших количеств неспецифической ДНК, что приведет к неправильному диагнозу. К тому же ПЦР идеально подходит для получения ответов типа «да-нет». Гораздо меньше этот метод пригоден для определения, какой организм из множества других присутствует в образце. Причина в том, что ПЦР лучше всего работает, когда в тестовой реакции находится только одна или несколько пар праймеров. Если в одной реакции используется большое число пар праймеров, соответсвующих всем возможным возбудителям инфекции, возникает серьезная проблема возможных артефактов. 4) Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности, а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом. 5) Для успешного проведения анализа важно правильно собрать биоматериал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. В настоящее время для забора крови существуют вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести забор материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР. 6) Методики, используемые при экстракции нуклеиновых кислот, должны максимально удалять антикоагулянты (например, гепарин) и остатки гема во избежание снижения эффективности амплификации. Системы с протеинкиназами являются более эффективными в сравнении с системами, основанными только на применении химических агентов. Некоторые системы позволяют выделять одновременно вирусные ДНК и РНК, что позволяет унифицировать этапы выделения нуклеиновых кислот при определении в одном образце как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов-мишеней. 7) Следует также иметь в виду, что ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, имеют склонность к ошибкам. Однако основной проблемой применения ПЦР в медицине является существенное ограничение информации о функции генов, участвующих в развитии большинства болезней человека. Сегодня чаще всего известны лишь симптомы этих заболеваний. 5. Применение ПЦР  |