5. Активность ферментов
 Скачать 64.5 Kb.
|
|
5.Активность ферментов Чтобы понять и правильно оценить результаты определения ферментативной активности, нужно совершенно отчётливо представить себе, от каких факторов зависит скорость реакции, какие условия оказывают на неё влияние. Влияние реакций среды Для большинства известных в настоящее время ферментов определён оптимум рН, при котором они обладают максимальной активностью. Эта величина - важный критерий, служащий для характеристик фермента. Иногда это свойство ферментов используют для их препаративного разделения. Наличие оптимума рН можно объяснить тем, что ферменты представляют собой полиэлектролиты и их заряд зависит от значения рН. Иногда сопутствующие вещества могут изменить оптимум рН, например буферные растворы. В некоторых случаях в зависимости от субстратов ферменты с неярко выраженной специфичностью имеют несколько оптимумов. Например, пепсин расщепляет белки яйца при рН 1,5- 2,0, синтетические субстраты - при рН 4,0. Отсюда следует, что величина (рН оптимум) - зависит от природы субстрата, состава буферного раствора и поэтому не является истинной константой. Нужно иметь в виду также свойства ферментов как белковых тел, способных к кислотно-щелочной денатурации. Кислотно-щелочная денатурация может привести к необратимым изменениям структуры фермента с утратой его каталитических свойств. Влияние химических факторов Присутствие в реакционной среде некоторых ионов может активировать образование активного субстрата ферментного комплекса, и в этом случае скорость ферментативной реакции будет увеличивается. Такие вещества получили название активаторов. При этом вещества, катализирующие ферментативные реакции, непосредственного участия в них не принимают. На активность одних ферментов существенно влияет концентрация солей в системе, другие ферменты не чувствительны к присутствию ионов. Однако некоторые ионы абсолютно необходимы для нормального функционирования некоторых ферментов. Известны ионы, которые тормозят активность одних ферментов и являются активаторами для других. К числу специфических активаторов относятся катионы металлов: Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cd2+, Cr2+, Cu2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Al3+. Известно также, что катионы Fe2+, Rb+, Cs+ только в присутствии Mg действуют как активаторы, в других случаях эти катионы не являются активаторами. В большинстве случаев один или два иона могут активировать тот или иной фермент. Например, Mg2+ - обычный активатор для многих ферментов, действующий на фосфорилированные субстраты, почти во всех случаях может быть заменён Mn2+, хотя другие металлы его заменить не могут. Следует заметить, что щелочноземельные металлы вообще конкурируют друг с другом, в частности, Са2+ подавляет активность многих ферментов, активируемых Mg2+ и Zn2+. Причина этого до настоящего времени не ясна. Механизм влияния ионов металлов - активаторов может быть различным. Прежде всего, металл может быть компонентом активного центра фермента. Но может действовать как связующий мостик между ферментом и субстратом, удерживая субстрат у активного центра фермента. Имеются данные о том, что ионы металлов способны связывать органическое соединение с белками и, наконец, один из возможных механизмов действия металлов как активаторов - это изменение константы равновесия ферментативной реакции. Доказано, что анионы также влияют на активность ряда ферментов. Например, очень велико влияние СI- на активность амилазы животного происхождения. Наряду с существованием активаторов ферментов известен ряд веществ, присутствие которых тормозит каталитическое действие ферментов или полностью инактивирует его. Такие вещества принято называть ингибиторами. Ингибиторы – это вещества, действующие определённым химическим путём на ферменты и по характеру своего действия, могут быть подразделены на обратимые и необратимые ингибиторы. Для обратимого торможения характерно равновесие между ферментом и ингибитором с определённой константой равновесия. Система такого типа характеризуется определённой степенью торможения, зависящей от концентрации ингибитора, при этом торможение достигается быстро и после этого не зависит от времени. При удалении ингибитора с помощью диализа активность фермента восстанавливается. Влияние температуры Температура – один из важнейших факторов внешней среды, который независимо от состояния равновесия реакции меняет её скорость. Поэтому при ферментативных реакциях при повышении температуры на 100 С процесс ускоряется в 1,5 – 2 раза. При дальнейшем повышении температуры присоединяются денатурационные процессы, характерные для всех белков и в том числе для ферментов, поэтому наблюдается затухание скорости реакции. Температурным оптимумом реакции называют температуру, при которой одно её действие вызывает ускорение реакции, катализируемой данным ферментом. Для большинства ферментов животного происхождения он равен 400 – 500 С, для растительного происхождения он равен 500 – 600 С. Почти все ферменты разрушаются при температуре 800 С. Но для некоторых ферментов в настоящее время доказана возможность восстановления их каталитической активности в случае обратимого процесса денатурации белка. Известны и такие ферменты, максимальная активность которых проявляется при более низких температурах. Например, каталаза, температурный оптимум которой лежит в пределах между 00-100 С. Понижение температуры снижает скорость ферментативных реакций. Большинство ферментов при 00 С ещё не утрачивают своих каталитических свойств, но при замораживании химические реакции прекращаются. При последующем оттаивании, если соблюдается определённые условия, ферментативная активность клеток может быть восстановлена. Влияние давления При изучении действия давления на скорость ферментативных реакций необходимо, прежде всего, учитывать, как и при изучении других факторов, возможность денатурации ферментов при высоком давлении. Если константа скорости ферментативной реакции растёт с повышением давления, то образование активного комплекса происходит с уменьшением объёма и наоборот, если при увеличении давления образование активного комплекса сопровождается увеличением объёма, то константа скорости реакции снижается. Влияние концентрации фермента и его субстрата Скорость любого ферментативного процесса в значительной степени зависит от концентрации, как субстрата, так и фермента. Обычно скорость реакции прямо пропорциональна количеству фермента, при условии, если содержание субстрата в пределах оптимума или немного выше. При постоянном количестве фермента скорость возрастает с увеличением концентрации субстрата. Эта реакция подчинена закону действующих масс и рассматривается в свете теории Михаэлиса – Ментона, то есть, V=K(F), V - скорость реакции K - константа скорости F - концентрация фермента. 6.Значение ферментов Постоянный обмен нуклеиновыми кислотами, составляет основную часть генетического материала клетки. В ходе обмена нуклеиновых кислот наряду с синтезом происходит и распад. Этот процесс катализирует большая группа ферментов, объединенных названием нуклеаз. Весь комплекс ферментов обмена нуклеиновых кислот выполняет важную биологическую задачу: сохранение в целостности генетического материала клетки и репарации (исправления) тех повреждений структуры ДНК, которые могут возникнуть в результате радиоактивного или ультрафиолетового облучения и других вредных воздействий. Известно, что все проявления жизнедеятельности связаны с затратой энергии. Эта энергия освобождается при химических превращениях в клетке тех веществ, которые в виде пищи поступают в наш организм. Задача пищеварения сводится к тому, чтобы превратить главные пищевые вещества: белки, углеводы и жиры, - в такие продукты, которые непосредственно смогут быть использованы во внутриклеточном обмене. Свой путь в организме пища начинает, попадая в рот, и уже на этом этапе она сталкивается с ферментами. В слюне содержится фермент амилаза, катализирующий разложения крахмала и превращение его в сахар. Разжёванная и смоченная слюной пища проглатывается и через пищевод попадает в желудок. Слизистая оболочка желудка вырабатывает желудочный сок. В желудочном соке есть соляная кислота, придающая желудочному содержимому кислую среду. Так же в желудочном соке имеется протеолитический (расщепляющий белки) фермент – пепсин. Он как раз лучше всего действует в кислой среде. Пепсин не расщепляет белки до конца, он только ''раскладывает'' крупную белковую молекулу на части, доступные для действия пищеварительных ферментов кишечника. Из желудка пищевая кашица поступает в двенадцатиперстную кишку, где на неё изливаются соки двух самых крупных желёз человеческого организма: печени и поджелудочной железы. Сок поджелудочной железы содержит большой набор ферментов, действующих на все важнейшие пищевые вещества. Ферменты: трипсин и химотрипсин (расщепляющие белки) расщепляют пептидные цепи в разных местах. Комбинированная атака протеолитических ферментов желудочного и поджелудочного соков приводят к распаду белков на мелкие пептиды, содержащие небольшое количество аминокислотных остатков. В поджелудочном соке содержится чрезвычайно активная амилаза, она практически полностью завершает расщепление крахмала, начатое слюной. В результате крахмал превращается в солодовый сахар – мальтозу – дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы. Третий главный компонент пищи – жиры тоже расщепляются под влиянием поджелудочного сока. Для этой цели там содержится специальный фермент – липаза. Простейшая и наиболее распространённая форма жиров – триглицериды. Под действием липазы молекула триглицерида присоединяет три молекулы воды и распадается на составляющие его глицерин и жирные кислоты. Но заключительную работу в области пищеварения совершает кишечный сок, вырабатываемый клетками слизистых оболочек тонких кишок. Он содержит много ферментов, заканчивающих процесс окончательного разложения пищевых веществ. Осколки белковых молекул распадаются на отдельные аминокислоты; мальтоза, образовавшаяся из крахмала, и другие сложные углеводы превращаются в простые углеводы – моносахариды – вроде глюкозы. На этом заканчивается процесс пищеварения. Одна из защитных реакций – свёртывание крови, происходит с участием ферментов. Кровь, как известно, состоит из жидкой части – плазмы и так называемых ферменных элементов, которые в ней плавают. Это кровяные клетки: эритроциты (красные кровяные тельца) и тромбоциты (кровяные пластинки). Плазма представляет собой сложный раствор многих веществ, в том числе самых разнообразных белков. Из белков плазмы для нас сейчас особый интерес представляет один – фибриноген. Пока кровь течёт по кровеносным сосудам, с фибриногеном ничего не происходит. Но стоит поранить сосуд настолько, чтобы кровь вытекала из него, как фибриноген очень быстро превращается в другой белок – фибрин. Фибрин, в отличие от фибриногена, не растворяется в плазме. В виде тонких нитей, переплетённых в густую сетку, он выпадает в осадок. В этой сетке застревают кровяные клетки, и образуется плотный сгусток – тромб, препятствующий дальнейшему кровотечению. Превращение фибриногена в фибрин – процесс ферментативный, катализируемый ферментом тромбином. Тромбин – протеолитический фермент, подобный трипсину и химотрипсину. Но это фермент очень специфичный. Он действует только на фибриноген, отщепляя от его молекулы два сравнительно небольших полипептида. Оставшаяся часть молекулы фибриногена перестраивается и превращается в нерастворимый фибрин. Также ферменты играют важную роль во всех проявлениях жизни. Успехи учения о ферментах внесли весомый вклад в развитие всех направлений человеческой практики. Ферменты нашли широкое применение в медицине. Это, прежде всего, изучение таких болезней причина, которых лежит в недостаточности тех или иных ферментов. Далее это использование определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях для диагностики различных заболеваний. И, наконец, это применение ферментов в качестве лекарственных средств. Генетически обусловленные нарушения. Время от времени в бесконечно длинных цепях ДНК, где записаны все инструкции по синтезу белков, вдруг появляются случайные замены: вместо одного нуклеотида становится другой. Такие замены называются мутациями. Чаще всего конкретные причины мутации неизвестны. А последствия их нередко бывают роковыми. Приведем такой пример. Люди отличаются друг от друга цветом кожи, волос и глаз. Причина этого – разные пигменты, меланины, синтезируемые из некоторых аминокислот под влиянием определённых ферментов. Если образование этих пигментов не происходит из-за отсутствия одного из участвующих в реакции ферментов, возникает альбинизм – отсутствие окраски. Люди альбиносы имеют очень белые волосы и светлые глаза. Альбиносы по здоровью не уступают людям с нормальной окраской. Гораздо более тяжёлым заболеванием, нередко приводящим к гибели новорождённых, является непереносимость простых углеводов – моносахаридов (галактозы и фруктозы). Здесь речь идёт о невозможности нормального обмена веществ в клетках из-за отсутствия необходимых ферментов. Достаточно подробно изучены врождённые болезни, связанные с недостатком ферментов, катализирующих разложение гликогена. В результате нарушения этого процесса гликоген начинает накапливаться в тканях в избыточном количестве и препятствует нормальному течению обмена веществ. Такие болезни получили название гликогенозов. Болезни, связанные с отсутствием витаминов, называют авитаминозом. Но по существу они являются ферментозами. Давно известна и когда–то была широко распространена болезнь ''бери – бери ''(сейчас её называют полиневритом – множественное воспаление нервов, в некоторых слаборазвитых странах она и теперь встречается нередко). Причина её отсутствие в пище витамина В1. Этот витамин – тиамин – в соединении с фосфорной кислотой представляет собой небелковую часть фермента декарбоксилазы. Декарбоксилаза разрушает карбоксильную группу (СООН) некоторых органических кислот, отщепляя от неё углекислоту (СО2). В отсутствии витамина В1 декарбоксилаза образоваться не может, реакция прекращается и в нервной ткани наступают нарушения, типичные для полиневрита: параличи конечностей, боли в мышцах, слабость, контрактуры. Тяжёлое заболевание – пеллагра – связано с отсутствием в пище витамина РР – никотиновой кислоты. Упомянем ещё об одном витамине. Он называется витамином В2, а по химической природе представляет собой довольно сложную циклическую структуру – рибофлавин. Авитаминоз В2 связан с тяжёлым поражением кожи лица и глаз. Причина - недостаток фермента группы ФАД. Ферменты также используются в диагностике. Определение активности ферментов в биологических жидкостях и тканях стало неотъемлемым средством лабораторной диагностики различных заболеваний. Для диагностических целей ферментативную активность определяют почти исключительно в крови, значительно реже в моче и лишь в отдельных случаях в тканях. Не все ткани в одинаковой мере синтезируют разные ферменты. Для печени, например, типична высокая активность одних ферментов, для почек или скелетных мышц – других. Это явление называют органоспецифичностью ферментов. Иногда органоспецифичность выражена очень чётко: фермент содержится только в каком–нибудь одном органе и отсутствует в других. Таким образом, врач получает возможность по повышению активности некоторых ферментов в плазме выявить заболевание, связанные с нарушением функций совершенно определенных органов. В последнее время предпринимаются всё более успешные попытки использовать ферменты и для лечения некоторых болезней. Уже давно некоторые ферменты применяют для так называемой заместительной терапии – для возмещения дефицита ферментов, возникающего при некоторых заболеваниях. Особенно успешна такая терапия при нарушениях функций желудочно-кишечного тракта, связанных с недостаточной выработкой пищеварительных ферментов. С успехом применяют ферменты в тех случаях, когда лечение требует разрушить накопившиеся в большом количестве белковые образования, мешающие нормальному функционированию тканей. Это бывает при ожогах, гнойных ранах, гнойно-воспалительных заболеваниях лёгких, когда в бронхах скапливается густая масса, препятствующая прохождению воздуха. Наметился очень перспективный путь применения ферментов для рассасывания сгустков крови, образовавшихся внутри кровеносных сосудов. Такие сгустки называются тромбами, они закупоривают сосуд и нарушают кровообращение. Велико значение ферментов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Сыроварение, виноделие, производство кисломолочных продуктов, пивоварение, производство колбасных продуктов, хлебопечение, производство животных жиров, чая, уксуса, лимонной кислоты – всё это и многое другое – технологические процессы пищевой промышленности, в которых главным действующим лицом являются ферменты. Одна из важнейших проблем пищевой промышленности – это развитие комплексной переработки сырья и отходов пищевой промышленности и повышение эффективности этой переработки. Ферментные препараты могут сказать здесь решающее слово. Серьёзной проблемой в консервной промышленности, переработки плодов и овощей является использование семян и косточек, главная трудность которого состоит в необходимости разрушать прочную оболочку косточек. И здесь реальную пользу могут принести препараты ферментов. С помощью ферментных препаратов удаётся уменьшить расход сырья растительного и животного происхождения, идущего на приготовления пищевых продуктов. Использование ферментов в сельском хозяйстве необычайно широко и разнообразно. В растениеводстве селекция многих сельскохозяйственных культур направлена на создание сортов, обогащённых определёнными ферментами. Это имеет значение и для скорости созревания культур, и для получения более высококачественной продукции, и для повышения устойчивости растений к изменению погодных условий, к болезням, к действию вредных насекомых. Специальный интерес представляет использования ферментов в кормопроизводстве. Агрономы заботятся о том, чтобы получить полноценный растительный корм, содержащий все существенные составные части, необходимые для обеспеченья потребностей животного организма. Вот здесь роль ферментов оказалась особенно значительной, как в пищевой промышленности. Ферментативные препараты для производства кормов получают из плесневых грибов и бактерий, но задачи здесь ставят иные. Для повышения усвояемости грубых кормов необходим фермент целлюлоза, гидролизирующий клетчатку и повышающий возможность её переваривания и усвоения, особенно у таких животных, как свиньи, которые переваривают клетчатку хуже, чем крупный рогатый скот. |