5. ГЕНЕТИКА МИКРОБОВв укороченный (1). Генетика микроорганизмов. Генная инженерия. Кыргызская Государственная
 Скачать 1.27 Mb.
|
|
Генетика микроорганизмов. Генная инженерия. Кыргызская Государственная Медицинская Академия Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии К.м.н., доц. Мырзакулова А.Ж. 1 Морфология бактериофагов и особенности их взаимодействия с бактериальной клеткой . • Бактериофаги ("пожиратели бактерий") – это вирусы бактерий. • Размеры такие же, как у вирусов, ( – 20 – 200 нм .) • Как и вирусы, бактериофаги проходят через бактериальные фильтры и размножаются только в живых клетках. • Бактериофаги в природе находятся там, где бактерии: в воде, почве, молоке, в организме людей и животных. 2 • С помощью электронного микроскопа показано, что большинство бактериофагов имеют форму головастика или сперматозоида. Они состоят из головки и хвостового отростка. • Отросток – стержень с чехлом. Стержень заканчивается шестиугольной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят фибриллы. Чехол может сокращаться. • Внутри головки находится ДНК. ДНК окружена капсидом. В отростке находятся ферменты – лизоцим и АТФаза. Они участвуют в проникновении фага в клетку. 3 4 • Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой называется бактериофагией. • Стадии взаимодействия фага с клеткой такие же, как и у вирусов: • адсорбция, • проникновение в клетку, • синтез нуклеиновых кислот и белков, • морфогенез, • выход из клетки. • Но имеются особенности. Фаги обладают строгой специфичностью взаимодействия. Определенный фаг взаимодействует с определенным видом или даже подвидом бактерий. По этому название бактериофагов такие же, как видовые или родовые названия тех бактерий, с которыми они взаимодействуют 5 • Интересен процесс проникновения фагов с хвостовыми отростками в клетку. • Эти фаги адсорбируются при помощи фибрилл, сокращается чехол (при помощи АТФазы), и стержень внедряется в клетку (при помощи фермента лизоцима). ДНК проходит через стержень в цитоплазму клетки. Капсид и отросток остаются вне клетки. Через 5 минут начинается синтез нуклеиновых кислот и белков, а через 30-40 минут бактериальная клетка разрушается (лизируется). В окружающую среду выходит около 200 новых фаговых частиц. 6 7 • Явление бактериофагии можно обнаружить при выращивании бактерий на жидких и плотных питательных средах. • На жидких средах при действии фагов наблюдается просветление жидкости с бактериальной культурой. . • На твердых средах на фоне сплошного роста бактерий образуются стерильные пятна круглой или неправильной формы. Они образуются на месте разрушения (лизиса) бактерий. Это "негативные колонии" бактериофага. 8 • Различают: • а) поливалентные фаги – взаимодействуют с родственными видами бактерий; • б) моновалентные – взаимодействуют с одним определенным видом; • в) типовые фаги – взаимодействуют с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. 9 • Получение и применение бактериофагов. • Для получения препаратов бактериофагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответствующие им типичные культуры бактерий. • В бактериальную культуру в жидкой питательной среде вносят маточную взвесь фага. После просветления (лизиса) культуру фильтруют через бактериальные фильтры, и фильтрат вносят в свежую культуру соответствующих бактерий и т.д. • После накопления достаточного количества фага лизированную им культуру бактерий вновь фильтруют, и получают препарат фага. 10 • Таким образом, препараты фагов получают путем многократного пассирования через чувствительную бактериальную культуру, а сами препараты фагов – фильтраты бульонных культур лизированных ими бактерий. • Это прозрачные жидкости светло-желтого цвета, а также на их основе готовят другие лекарственные формы - таблетки с кислотоустойчивым покрытием, мази, аэрозоли, свечи. 11 • Применение фагов основано на их строгой специфичности. Они используются для: • а) диагностики инфекционных заболеваний (диагностические препараты): с помощью известного фага можно определить вид или подвид бактериальной культуры; • б) лечения и профилактики заболеваний (лечебно-профилактические препараты). 12 Лечебно-профилактические препараты бактериофагов • В настоящее время выпускают бактериофаги для лечения и профилактики кишечных инфекций: дизентерийный поливалентный, сальмонеллезный поливалентный групп АВСДЕ, брюшнотифозный и бактериофаги против основных возбудителей гнойно- воспалительных заболеваний: стафилококковый, стрептококковый, синегнойный, протейный, клебсиеллезный, коли-фаг. 13 • Разработаны комбинированные препараты: • коли-протейный, • пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протея, синегнойной и кишечной палочек), • интести–бактериофаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, кишечной и синегнойной палочек, протея). 14 • Поливалентные препараты – смеси из нескольких фагов против различных типов одного вида бактерий. • Комбинированные препараты – смеси из фагов против бактерий разных видов. 15 • Механизм действия: 1) лизис (гибель) бактерий в очаге воспаления; 2) стимуляция иммунитета. • Преимущества: • 1) специфичность действия (вызывают гибель определенного вида бактерий); • 2) не подавляют нормальную микрофлору организма человека, как антибиотики; • 3) нет противопоказаний и осложнений; 16 • 4) можно использовать в сочетании с другими лекарственными средствами; • 5) активны против бактерий, устойчивых к антибиотикам; • 6) можно использовать для профилактики заболеваний. • Недостатки: • 1) быстро выводятся из организма; • 2) срок годности 12 – 24 мес; • 3) хранятся при температуре +2 - 10 С. 17 • Важное условие успешного применения бактериофагов: чувствительность возбудителя к данному бактериофагу. Лечение фагами нужно начинать в первые дни заболевания. Вводить препараты нужно в места локализации возбудителя. 18 • Препараты назначают внутрь (через рот и в виде клизм), местно для орошения ран и слизистых оболочек, вводят в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, в брюшную и плевральную полости, а также в полости абсцессов после удаления гноя и экссудата. • Так как бактериофаги разрушаются кислотами, поэтому препараты, которые назначают для приема через рот, имеют кислотоустойчивое покрытие. 19 • Генетика изучает два важнейших свойства микроорганизмов: наследственность и изменчивость. Под наследственностью понимают сохранение специфических свойств у микроорганизмов на протяжении ряда поколений. Вместе с тем наследственность обеспечивает сохранение не только сходства, но и различий, возникающих благодаря изменчивости наследственных свойств. 20 • Микробы гаплоидны, т.е. имеют один набор генов в единственной хромосоме. Кроме основной молекулы ДНК, являющейся хромосомой бактерий, у них может быть дополнительный генетический материал: плазмиды, транспозоны, Is- элементы, профаги, которые изменяют свойства микробов. 21 • Носителем генетической информации у бактерий является ДНК, состоящая из генов. • Ген – это участок ДНК, кодирующий синтез одного белка (или пептида). • Генотип микробов – это совокупность всех генов микробной клетки. • Фенотип – это совокупность свойств микробов, которые выявляются в определенных условиях. • Изменение генотипа называется генотипической изменчивостью, а фенотипа – фенотипической изменчивостью. 22 ФОРМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ • Ненаследственная фенотипическая. • Наследственная генотипическая. • Генотипические признаки – внешний вид, структура, физиология любого организма находится под контролем генов. 23 • Фенотипические изменения микроорганизмов носят характер временных физиологических нарушений и легко обратимы. Как правило, эти изменения исчезают сразу же после прекращения воздействия вызвавшего их фактора. • Длительные модификации - это те, которые наблюдаются в течение ряда поколений после того, как индуцировавший фактор перестал действовать (стабильные). 24 • Фенотипической изменчивости может подвергаться и морфология бактериальных колоний. Так, при выращивании возбудителей бруцеллеза на плотных питательных средах с добавлением небольших доз пенициллина наблюдали возникновение колоний в R- форме (шероховатая поверхность). При пересеве бруцелл из этих колоний в R –форме на среду, лишенную пенициллина, вырастили колонии имеющие обычную S-форму (гладкая поверхность колоний). 25 • Примером модификаций является нарушение синтеза клеточной стенки. Например, воздействия пенициллина или иммунной сыворотки появляются L- формы бактерий. L- формы – это вариант микроорганизмов утративших полностью или частично клеточную стенку. Они могут сохраняться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. 26 • Наследственную функцию бактерий выполняет ДНК. Молекула ДНК построена из двух полунуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из 3-х компонентов: азотистого основания, пятиуглеродного сахара и фосфорной кислоты. Азотистые основания представлены пуринами (аденин, гуанин) и пиримидинами (пимин, цитозин). 27 • Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген. Бактериальный геном состоит из репликонов, способных к самостоятельной репликации. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды. Бактериальная хромосома представлена одной двуцепочной молекулой ДНК кольцевой формы, имеет гаплоидный набор генов кодирует жизненно важные для клетки функции. 28 29 • Плазмиды бактерий представляют собой и двуцепочные молекулы ДНК, размером намного меньше хромосомы. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но дающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Например, устойчивость к антибиотикам, продукция факторов патогенности. 30 • Некоторые плазмиды могут встраиваться в бактериальную хромосому и называться интегративными. Другие плазмиды способны перемещаться из одной бактериальной клетки в другую, даже принадлежащую к иной таксономической группе. Такие плазмиды называются трансмиссивными (конъюгативными). 31 32 33 • Основные группы плазмид • 1. Плазмиды обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам – это R – плазмиды ( resistance - противодействие) содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, разрушающих антибактериальные препараты, имеющие R – плазмиду. В результате бактерии, становятся устойчивыми (резистентными) к действию лекарственных препаратов. 34 • 2. Плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности это Ent – плазмиды, определяют синтез энтеротоксина; Hly- гемолизин плазмида, детеминирует синтез гемолизина у E.coli. col – плазмида определяет синтез колицинов, обладающих активностью по отношению к колиформным бактериям. 35 • Подвижные генетические элементы • В состав бактериального генома и плазмиды входят подвижные элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны. • Вставочные – (инсерционные) последовательности их называют IS элементы (от англ. insertion – вставка, seguences – последовательность). Это участки ДНК, включающие 1000 пар нуклеотидов, способные перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. 36 • Транспозоны это участки ДНК, включающие от 2000 до 20000 пар нуклеотидов, обладающие теми же свойствами, что вставочные последовательности, но имеют гены, обеспечивающие синтез бактериальных токсинов, ферментов, разрушающих антибиотики. 37 • Перемещаясь по репликону или между репликонами подвижные генетические элементы вызывают: 1) повреждение генетического материала – дупликации, делеции, инверсии; 2) инактивацию генов; 3) слияние репликонов, т.е. встраивание плазмиды в хромосому; 4) распространение генов в популяции бактерий, то может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний. 38 • Наследственная изменчивость • Изменения бактериального генома могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций. • Мутации, возникающие как следствие изменения в последовательности азотистых оснований в молекуле ДНК, приводят к утрате или изменению какой – либо функции. • По происхождению мутации условно подразделяются на спонтанные (естественные) и индуцированные (экспериментальные). 39 • Мутации могут быть спонтанными, т.е. возникающими самопроизвольно, без воздействия из вне, и индуцированными. Индуцированные мутации появляются под влиянием внешних факторов- мутагенов. Мутагены бывают физическими (уф – лучи, радиация), химическими – азотистая кислота и ее аналоги, и другие соединения и биологическими - транспозоны. 40 • Спонтанные мутации образуются в результате интеграции в молекулы ДНК Is – элементов, транспозонов некоторых бактериофагов. Таким образом, спонтанные мутации всегда причинно обусловлены. Однако, вызвавшие их мутагенные факторы неизвестны. 41 • В зависимости от того, где происходят мутации, их подразделяют на генные и хромосомные. Генные мутации – это те, которые имеют место в пределах одного гена. Хромосомные мутации обычно захватывают несколько генов. 42 • Точечные мутации – это мутации, при которых изменяет лишь одна пара нуклеотидов в молекуле ДНК. Во –первых, к ним относятся мутации, возникающие в результате выпадения или вставки одной пары азотистых оснований. В результате этого происходит нарушение порядка считывания информации при синтезе белка на информационной РНК в рибосомах. 43 • Во – вторых, к точечным мутациям принадлежат мутации, возникающие в результате замены в ДНК отдельных пар азотистых оснований. • Хромосомные мутации представляют собой крупные перестройки, затрагивающие значительные фрагменты ДНК. К ним относятся делеции, инверсии, дубликации. 44 • Делеции – это выпадение большого окличества нуклеотидов. • Инверсии – поворот участка ДНК на 180 °. • Дубликации – повторение участка хромосомы. 45 • Причиной хромосомных мутаций является интеграция в ДНК бактерий мигрирующих (перемещающихся) нуклеотидных последовательностей: Is – элементов и транспозонов. • Мутации, вызывающие появление мутантного фенотипа, называются прямыми мутациями.. наряду с ними, у микробов могут возникать мутации, ведущие к восстановлению дикого фенотипа. Они называются обратными мутациями. 46 • Своеобразной формой изменчивости является диссоциация бактерий. Она возникает в результате расщепления бактериальных клеток и образования двух форм бактериальных клеток, отличающихся друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. 47 • Первый тип R – колоний (неровный) характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип S – колонии (гладкий) имеет круглую форму, ровные края, гладкую поверхность. 48 49 • Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют туберкулезные, чумные, сибиреязвенные микробы. S- R диссоциация возникает после встраивания в бактериальную хромосому. Внехромосомных факторов наследственности плазмид, транспозонов, вставочных последовательностей и умеренных фагов. 50 • Рекомбинации у бактерий • Рекомбинация – это процесс передачи и обмена генетического материала между бактериями, так и с хромосомой бактериальной клетки и обеспечивают их рекомбинацию. 51 • Механизмы рекомбинации • Генетические рекомбинации – это процесс в ходе которого из ДНК двух разных родительских клеток образуется рекомбинантная хромосома. • В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки – доноры, которые передают генетический материал, и клетки реципиенты, которые материал воспринимают. В клетку – реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки –донора, т.е. один или несколько генов образуется только один рекомбинант, представленный в основном генотипом реципиента с фрагментами хромосомы донора. 52 53 • Для осуществления обмена генетическим материалом у бактерий существуют разные пути его доставки. Это – трансформация, конъюгация и трансдукция. В результате мутаций и рекомбинаций у микробов появляются новые свойства . в частности, может изменяться вирулентность, устойчивость к лекарственным препаратам синтез ферментов и антигенов. 54 • Первый механизм, который был обнаружен – это трансформация. Трансформация была обнаружена впервые у пневмококков. Пневмококки, содержащиеся в мокроте больного пневмонией всегда имеют полисахаридную капсулу и на чашках с сывороточным агаром образуют S-колонии. Если культуру капсульных пневмококков многократно пересевать на питательную среду, то появляются R- колонии в которых микробы лишены капсулы и авирулентны. 55 • В 1928 г . Гриффитс обнаружил, что если внести мышам подкожно большое количество живых безкапсульных пневмококков вместе с убитыми нагреванием капсульными пневмококками, то через несколько дней мышь гибнет. На вскрытии из крови и органов высевается капсульный пневмококк, результат капсульные пневмококки были убиты и размножаться не могли, а тем не менее в крови капсульные пневмококки. 56 • Следовательно, из мертвых клеток капсульного пневмококка выделилось ДНК и встроилось в хромосому без капсульного пневмококка. В результате пневмококки приобрели способность синтезировать капсулу, т.е. трансформация – это такой механизм генетической рекомбинации, во время которого клетка реципиент поглощает и встраивает в свою хромосому растворенную ДНК, вышедшую из клетки донора. • Конъюгация – передача генетического материала от клетки донора в клетку реципиент путем непосредственного контакта клеток. 57 • Конъюгация – передача генетического материала от клетки донора в клетку реципиент путем непосредственного контакта клеток. 58 59 • Необходимым условием является наличие в клетке донора фактора плодовитости- F – фактора от англ. fertile- плодовитость. F – фактор распологается в цитоплазме в виде кольцевой двуцепочной молекулы ДНК, является плазмидой. Она содержит гены, контролирующие процесс конъюгации и синтез F – пилей 1) клетки –доноры, обладающие F – фактором, обозначаются как F+ клетки, а клетки –реципиенты не имеющие F – фактора - F – клетки. 60 • F – пили , образуют конъюгационную трубочку между клеткой- донором и клеткой – реципиентом по которой плазмидная ДНК передается из бактерии-донора в бактерию – реципиент. В результате такого переноса клетка- реципиент получает донорские свойства. Если F – фактор встраивается в хромосому клетки – донора, то хромосома донора приобретает способность с высокой частотой передаваться в клетку –реципиент. 61 • Поэтому донорские клетки, имеющие встроенную в хромосому F – фактор, называются Hfr (эйч, фи,эр) клетками – высокая частота рекомбинаций. Перенос хромосомных генов при конъюгации всегда имеет одинаковую направленность и поэтому используется для картирования генома бактерий и построения генетической карты. 62 • Трансдукция (от лат. transductis - перенос, перемещение) – передача ДНК от бактерии донора к бактерии –реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую - перенос определенного фрагмента ДНК донора в определенные участки ДНК реципиента. 63 • Так, с помощью фага можно перенести любые гены, например гены контролирующие способность синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, гены резистентности к антибиотикам, ферментативные свойства, токсигенность, вирулентность и другие признаки. 64 • Механизм трансдукции – в процессе репродукции некоторых умеренных фагов небольшие фрагменты ДНК бактерий доноров встраиваются в геном фага, который переносит их в бактерии реципиенты. 65 66 • Генная инженерия • Генетическая инженерия – это процесс получения рекомбинантных ДНК. Метод состоит из нескольких этапов: а) выделение ДНК из клеток организма; б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК путем встройки в исходную ДНК «чужого» гена, выделенного из другой ДНК или полученного химическим синтезом; 67 • в)введение рекомбинантной ДНК в живую клетку (бактерий, дрожжей, растений, животных, человека); г)создание условий для проявления генов рекомбинантной ДНК в живой клетку и секреции нового продукта, кодируемого «чужим» геном. 68 • На этом принципе в настоящее время получены сотни рекомбинантных штаммов бактерий, дрожжей, способных продуцировать антигены, антитела, ферменты, гормоны, интерфероны. 69 Применение генетических методов в диагностике инфекционных болезней • Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различной ДНК. • Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амфликации, т.е. увеличении количества копий специфического («маркерного») гена возбудителя. Для этого двухнитчатую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают») и достраивают к «расплетенным» нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. 70 • Этот процесс копирования генов многократно повторяется при различных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит в пробирке (in vitro) при добавлении к амплифицируемым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК), ДНК – полимеразы и нуклеотидов. 71 |