Геномика, протеомика и бионика. Их значение для поиска новых лекарственных средств
 Скачать 4.46 Mb.
|
Тема: Геномика, протеомика и бионика. Их значение для поиска новых лекарственных средствЛекция по биотехнологии кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологииПланГеномика. Определение. Характеристика. Методы. Значение. Протеомика. Определение. Характеристика. Методы. Значение. Бионика. Определение. Характеристика. Методы. Значение. ГеномикаГеном — это вся ДНК в гаплоидном наборе хромосом данного вида; Раздел генетики, посвященный изучению целых геномов живых организмов, называют геномикой; Для выполнения работ в области геномики используют различные методы молекулярной генетики, из которых особо нужно выделить полимеразную цепную реакцию и ДНК-секвенирование; Полимеразная цепная реакцияПолимеразная цепная реакция является методом быстрого "клонирования" определенной части ДНК в пробирке в течение 30-40 циклов; Полимеразная цепная реакция была изобретена американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году; Широкий уровень возможностей, дешевизна и простота ПЦР позволили этому методу найти применение в различных областях генетических исследований; В основе ПЦР лежит естественный процесс клеточной репликации; Каждый цикл состоит из трех этапов: 1) денатурация;2) отжиг праймеров;3) синтез ДНК;Для каждого шага существует специальный температурный и временной интервал:1. денатурация (94 °С, 0,5-1 мин);2. отжиг праймеров (35-65 °С, 0,5-1 мин);3. синтез (72°С, 0,5-1 мин);Аккуратное выделение ДНК, амплификация ДНК, и детекция продуктов амплификации (электрофорез) обеспечивают высокое качество полимеразной цепной реакции; Количество ампликонов фрагмента ДНК из одной клетки, образованных во время ПЦР, может быть найдено по следующей формуле: F = 2n, n — число циклов; Типичная реакционная смесь для ПЦР: 5хПЦР-буфер – 5 мкл; MgSO4, 50 мM – 1,5 мкл; H₂O (дистиллированная) – 3 мкл; дНТФ-микс, 2 мM – 2,5 мкл; Taq-буфер, 5 ед/мкл – 0,5 мкл; минеральное масло – 10,5 мкл; 2 праймера, 3,3 ОЕ/мл – по 1 мкл; ТЕ-буфер с ДНК – 5 мкл; ДНК-секвенированиеМетод определения порядка нуклеотидных оснований в ДНК-мишени; Этот метод был изобретен британским ученым Фридериком Сенгером в 1975 г; В качестве матрицы при ДНК-секвенировании используется одноцепочечная ДНК; Для инициации секвенирования ДНК-полимеразой используются синтетические праймеры или природные субфрагменты, полученные при помощи рестриктаз; 3'-конец праймера должен заканчиваться перед участком ДНК, который будет секвенироваться; Для выяснения последовательности нуклеотидов в целевой части ДНК проводят 4 полимеразные реакции; В каждую из четырех смесей реакции обязательно нужно добавить дезоксинуклеозидтрифосфаты (дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ) и ДНК-полимеразу; Кроме этого в каждую из пробирок добавляют один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ и ддАТФ); С помощью электрофореза продукты полимеризации ДНК разделяют и получают последовательность целевой ДНК; Разделы геномикиВ рамках геномики проводятся исследования по: функциональной геномике; сравнительной (структурной)геномике; генетическому разнообразию; Важнейший элемент геномных исследований — характеристика различных генов, составляющих эти геномы, изучение механизмов их регуляции, взаимодействия друг с другом и с факторами среды в норме и при патологии; Охарактеризовать таким образом как можно большее количество генов - основная задача функциональной геномики; Чтобы ответить на вопрос, как функционируют и как регулируются примерно 25 000 генов, составляющих геном человека, необходимы длительные мультидисциплинарные исследовавния; Еще одно важное направление функциональной геномики — транскриптомика — изучает координированную работу генов, образование первичных транскриптов, процессы сплайсинга и формирования зрелых мРНК; Благодаря технологии микрочипов удается одновременно анализировать картину транскрипции мРНК со ста тысяч генов; Исследование «транскриптома» этим методом позволяет установить различия между экспрессией генов в разных тканях, проанализировать характер экспрессии в разные периоды болезни, а также классифицировать белки - на секретируемые и связанные с мембранами (определяя положение их мРНК); В рамках еще одного направления функциональной геномики - ни гомики исследуют генетические механизмы и генетический контроль клеточной дифференцировки и гистогенеза, а также образования субклеточных структур; Технологии, позволяющие анализировать молекулярные механизмы путем сравнения генов или их продуктов в разных органах и тканях, а также геномов различных организмов, развиваются в рамках сравнительной геномики; Так, сравнения белковых последовательностей внутри и между видами организмов помогают получить информацию об их потенциальных функциях; Однако при неудаче простого сравнительного анализа, основанного на гомологии с другими белками и/или на их трехмерном строении, определяют разные компоненты белковых комплексов и/или клеточных структур перед тем, как их истинная функция станет очевидной; Изучение координации внутри клетки и организма действия пакетов генов путем сравнения геномов разных видов основано на том, что жизненно важные регуляторные функции сохранились у многих видов организмов на протяжении эволюции; Например, информация о регуляции клеточного цикла, необходимая для понимания процесса канцерогенеза у человека, была получена путем сравнения с аналогичными процессами у дрожжей; Геномы прокариот и эукариотГеном содержит порядка 1000 генов, локализованных в одной кольцевой молекуле ДНК нуклеоида — ядерного аппарата бактерий; Отсутствуют интроны в генах; Имеются сложные транскриптоны, содержащие группу последовательно расположенных структурных генов, на одном фланге которой расположен инициатор, а на другом терминатор; Такой прокариотический транскриптон называют опероном; Как правило, структурные гены оперона контролируют комплекс взаимосвязанных или последовательно реализуемых функций; Геном прокариот на примере E. coliВсе гены прокариот можно разделить на конститутивные и индуцибельные; Конститутивные гены постоянно включены, их еще можно назвать генами «домашнего хозяйства»; Индуцибельные гены могут включаться и выключаться, их активность может регулироваться по принципу «больше или меньше»; Их еще называют «генами роскоши»; Включение индуцибельных генов называют индукцией, а выключение — репрессией; Структурные гены бактерий имеют тенденцию быть организованными в кластеры генов, кодирующих белки, чьи функции связаны; Примером кластерной организации у E. coli являются лактозные гены, которые индуцируются и репрессируются под действием субстрата; Вся система, включающая структурные гены и элементы, контролирующие их экспрессию, формируют общую единицу регуляции, называемую опероном; Модель оперона была предложена Ф. Жакобом и Ж. Моно в 1961 г; У кишечной палочки обнаружено 2584 оперона; У эукариот опероны не обнаружены; Последовательность расположения генов в опероне следующая: промотор, оператор, структурные гены (отвечают за метаболизм лактозы), терминатор. Промотор имеет сайт посадки для РНК-полимеразы; Транскрипция структурных генов контролируется белком-репрессором, кодируемым геном lacI; Структурные гены контролируются негативно: транскрипция их идет до тех пор, пока не будет выключена белком репрессором; Белок lac-репрессор связывается с оператором на старте транскрипции структурных генов и предотвращает движение РНК-полимеразы и инициацию транскрипции; Белок репрессор имеет 2 сайта связывания: один для индуктора, другой для оператора; Когда индуктор (лактоза) поступает в клетки и связывается со своим сайтом, это так изменяет конформацию молекулы белка, что нарушается связывающая способность другого сайта; В результате репрессор становится не способным сдерживать транскрипцию, и она начинается; При удалении индуктора репрессор вновь занимает положение на операторе, останавливая транскрипцию; ЭукариотыГенетический материал имеется не только в ядерном аппарате (хромосомах ядра), но и некоторых органоидах, поэтому геном эукариот состоит из нескольких разных компонентов; Ядерный геном содержит ядерные гены и называется нуклеомом; Митохондриальный геном содержит митохондриальные гены и называется хондриомом; Пластидный геном содержит пластидные гены и называется пластидомом; Имеется экзон-интронная структура (мозаичное строение); Каждый транскриптон включает в себя, как правило, только один структурный ген; При изучении первичной структуры некоторых генов выяснилось, что в них имеются участки, которые ничего не кодируют, т. е. они подобны межгенным спейсерам, но только внутри гена; Группы ученых, возглавляемых Р. Робертсом и Ф. Шарпом, обнаружили такие расщепленные гены у аденовируса в 1977 г; Некодирующие участки получили название интронов, а кодирующие экзонов; У бактерий и вирусов, поражающих бактерий, интронов нет; По данным проекта «Геном человека» только 1 % генома приходится на экзоны, а 24 % на интроны; Главной особенностью генетического материала эукариот по сравнению с прокариотами является наличие избыточной ДНК; К примеру, геном Escherichia coli на 88,6 % занят генами, а межгенные участки составляют около 11 %; Средний размер промежутков — 118 п. н. Однако и межгенные промежутки очень часто выполняют регуляторную функцию; В конце 60-х годов американские ученые Р. Бриттен и Э. Дэвидсон открыли фундаментальную особенность молекулярной структуры эукариот — наличие последовательности нуклеотидов различной степени повторяемости; Расположение генов в геномеГены в геномах расположены по принципу интерсперсии (чередования), т. е. уникальные последовательности чередуются с повторяющимися; I тип — по типу Xenopus laevis (человек, млекопитающие, большинство животных); Уникальные последовательности длиной около 1500 п. н. чередуются с повторяющимися длиной около 300 п. н. В остальной части геномов типа «ксенопус» расстояния между соседними повторами значительно превышают 1-2 т.п.н. ; У человека повторы длиной около 300 п. н. содержат сайт, разрезаемый ферментом рестрикции Alu I; Число таких повторов достигает 500000 – 5000000 копий; 50 % генома построены по этому типу; II тип – по типу Drosophila melanogaster; Уникальные последовательности длиной не менее 13 000 п. н. чередуются с повторяющимися длиной около 5 600 п. н. 90 % генома построены по этому типу; Интересно отметить, что у Musca domestica, близкого Drosophila melanogaster, геном устроен по типу «ксенопус»; Птицы по параметрам интерсперсии занимают промежуточное положение между типом «ксенопус» и типом «дрозофила»; Многие виды нельзя отнести ни к тому, ни к другому типу. ХондриомУ млекопитающих каждая мтДНК содержит 15 000 – 17 000 пар оснований; У человека хондриом состоит из 16565 п. н. Содержит 37 генов: 13 кодируют белки, 22 – гены тРНК, 2 – рРНК; Один из самых маленьких геномов имеет малярийный плазмодий — около 6 000 п. н.; Некоторые растения имеют огромные молекулы мтДНК (до 25 млн. п. н.); В митохондриальной ДНК растений имеются некодирующие повторяющиеся последовательности; Как правило, в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома; Так, в клетках печени человека около 2 тысяч митохондрий и в каждой из них содержится по 10 одинаковых геномов; ТеломерыКонцевые участки хромосом; Характеризуются отсутствием способности к соединению с другими хромосомами; Повторы теломер: - Позвоночные: ТTAGGG;- Насекомые: TTAGG;- Большинство растений: TTTAGGG;Критическая длина человеческой теломеры, при которой хромосомы начинают соединяться друг с другом — 12,8 теломерных повторов; Теломеры человека содержат тысячи повторов TTAGGG. 3`-конец хромосомы свисает над 5`-концом хромосомы; Этот свес при помощи водородных связей формирует сам на себя не уотсон-криковскую пару C-G, а G-G, и соединяется с белками, которые защищают этот свес от излишней рекомбинации; Молекулярно-генетическое изучение теломер осложняется тем, что число их в каждой клетке невелико: по две в каждой хромосоме. Мобильные элементыВ начале 40-х годов американская исследовательница Б. МакКлинток открыла существование гена, или локуса, который вызывал повышение частоты хромосомных перестроек у кукурузы. В 1948 г. она опубликовала результаты исследований этого локуса, вызывающего разрывы хромосом, сделав вывод, что он является совершенно необычным, поскольку может перемещаться из одного участка хромосомы в другой. Б. МакКлинток назвала феномен перемещения транспозицией, а сами локусы — контролирующими элементами. Эти элементы характеризуются следующими свойствами: - они могут перемещаться из одного сайта в другой,- их встраивание в данный район генома влияет на активность генов, расположенных рядом, утрата контролирующего элемента в данном локусе превращает прежде мутабильный локус в стабильный, в сайтах, где присутствуют контролирующие элементы, могут возникать делеции, транслокации, транспозиции, инверсии, а также разрывы хромосом.Геном человекаГеном человека полностью открыт в 2003 году. У человека он состоит из 3млрд пар оснований, закончено описание всех генов и их распределение по хромосомам. Выяснена роль всех генов, при этом стало ясно, что не все наследственные признаки записаны в ДНК, в геноме записана только информация о структуре белков. Протеомика – это изучение белков – как продуктов определенных генов и роли этих белков. Белки – это самообучающиеся молекулы, т.е. в течение жизни они взаимодействуют между собой и это взаимодействие запускает метаболические цепи и процессы. Гены состоят примерно из сотен или даже тысяч пар мононуклеотидов, идентификацию гена осуществляют с помощью цис-транс-теста, поэтому ген иначе называют цистроном. Ген может существовать во многих альтернативных состояниях – множественные аллели. Каждое аллелеморфное состояние представляет определенную конфигурацию гена (аллель – альтернативное состояние гена). Неинформативные участки называются интронами. Предполагается, что интроны играют роль регуляторных сигналов. В ДНК также выявлены подвижные участки – «прыгающие» гены, перемещение которых объясняется механизмами обратной транскрипции. Эти гены играют определенную роль в развитии онкозаболеваний, т.к. встраиваясь рядом с онкогеном, они активируют его. В ДНК имеются повторяющиеся последовательности, которые состоят из 2-6 пар оснований и повторяющиеся до 50 раз (микросателлитные повторяющиеся последовательности). Большинство генов связано с этими последовательностями и это позволяет определить связь гена с определенной болезнью. Нестабильность микросателлитных последовательностей (например, увеличение в них тринуклеотидных последовательностей) может вызывать ту или иную болезнь. Например, нестабильный ЦГГ повтор связан с синдромом Х; ЦАГ – с хореей Гентингтона и спинобульбарной мышечной атрофией; ЦТГ – с миотонической дистрофией. Персональная медицина и фармакогеномикаФармакогеномика — наука, изучающая наследственную расположенность к ответу на лекарственные препараты; Некоторые основания для развития фармакогеномики как науки: - лекарство может лечить, а может и вредить;- человек выбирает лекарство думая или чувствуя, что оно может работать, а не зная точно;- при лечении какой-либо серьѐзной болезни (например, рака) каждый новый курс терапии снижает шанс на выздоровление;- большое количество средств тратится впустую.Сложных заболеваний, таких как рак, требующих серьезного подхода к лечению, фиксируется каждый год огромное множество. Только в США в 2012 году зафиксировали 710040 случаев рака среди мужчин (чаще всего рак простаты ― 33 %) и 662870 случаев среди женщин (чаще всего рак молочных желез ― 32 %). Большинство противоопухолевых препаратов токсичны. Например, тиогуанин и меркаптопурин применяются для химиотерапии острой лейкемии, а также для профилактики отторжения пересаженных органов и тканей. В норме фермент тиопуринметилтрансфераза обезвреживает эти вещества, однако у одного человека из трехсот он отсутствует, а примерно у 10 % людей его активность снижена. Эффективность виагры в немалой степени определяется модификациями гена GNB3, кодирующего несколько сигнальных белков. Среди мужчин, располагающих TT-модификацией этого гена, эффективность виагры составляет около 90 %. У пациентов с модификациями ТС и СС успех терапии отмечается лишь в половине случаев. Еще один из примеров неправильного подхода в лечении болезней без учета индивидуальных особенностей организма можно привести на основе лекарства варфарин. Варфарин — антикоагулянт, применяемый для предупреждения тромбозов. Известно, что эффективность метаболизма варфарина зависит от гена CYP2C9. В результате мутации и последующей замены изолейцина на лейцин в 359 положении вызывает существенное снижение ферментативной активности, такой аллель называется CYP2C9*3. Если прописать такому пациенту дозу 5 мг/день, то простой порез может привести к серьезному кровотечению. Таким пациентам нужно прописывать 0,5-1 мг/день. Развитие фармакогеномики пока тормозится тем, что определить функцию гена не очень просто. ПРОТЕОМИКАПосле расшифровки генома усилия исследователей фокусируются на изучении белковых продуктов генов; Этим занимается протеомика; Ее задача — определить все белки, синтезируемые в клетке, выяснить их строение, количество, локализацию, модификацию и механизмы взаимодействия Ученые в области протеомики исследуют «производство» протеинов, их разрушение, и замену белков внутри тела. Они также изучают как протеины модифицируются в организме после их образования. Часто можно проследить связь между изменениями протеинов и их взаимодействием и болезненными состояниями. Таким образом, можно значительно ускорить разработку лекарственных средств и вложить в руки пациента новое эффективное лекарство. Нужно отметить, что сегодня более 95 % всех фармакологических средств на рынке нацелены на воздействие на протеины. Преимуществом протеомики перед геномикой является тот факт, что наличие какого-либо гена в геноме не означает, что с него производится транскрипция, а наличие транскрипта не означает, что с него происходит трансляция, а даже если происходит, то транскрипт не позволяет однозначно говорить о структуре белка, его созревании и локализации. Для системных исследований информационных РНК (транскриптов) используют термин «транскриптомика», а для системных исследований белков ― «протеомика». Основной метод в области протеомики ― двумерный электрофорез. Двумерный гель-электрофорезПри анализе белков и пептидов одной из ключевых стадий является предварительное разделение исследуемых соединений. На сегодняшний день существует множество различных методов для решения данной задачи: электрофорез, хроматография, твердофазная экстракция, обогащение и т. д. Среди всех перечисленных методик стоит отдельно остановиться на методе двумерного гель-электрофореза в полиакриламиде (2-D PAGE). Данный метод решает задачу не только разделения, но и визуализации, а также может быть использован для оценки количества определенных белков. 2-D PAGE представляет собой метод разделения смеси белков, основанный на последовательном использовании двух их свойств: заряда и массы. Использование таких не связанных между собой свойств протеинов необходимо, чтобы разделение смеси было максимальным. Первое направление разделения белков (также называемое изоэлектрофокусированием, IEF) основано на таком их свойстве как изоэлектрическая точка (pI – isoelectric point). Изоэлектрическая точка определяется аминокислотным составом белка и меняется при посттрансляционных модификациях. Когда белок попадает в гель с градиентом pH, к которому приложено электрическое поле, он начинает двигаться к электроду с противоположным зарядом: положительно заряженные белки перемещаются к катоду, а отрицательно заряженные – к аноду. Во время миграции белок присоединяет или теряет протоны, в результате чего его заряд и подвижность снижаются и становятся нулевыми при достижении белком точки в градиенте pH, равной его pI. В этой точке он считается «сфокусированным», а на геле он выглядит как четко очерченное пятно. С помощью 2DE можно разделить белки с очень близкими pI. Далее гель, полученный в ходе изоэлектрофокусирования, кладут горизонтально на вершину полимеризованного между двумя стеклами геля, и начинается второе направление электрофореза, в ходе которого происходит разделение белков по массе. Разновидностью 2-D PAGE является метод дифференциальной окраски разных белковых образцов флюоресцентными красителями (Cy3, Cy5, Cy2) с последующим разделением их на одном геле. По сравнению со стандартным 2-D PAGE этот метод позволяет избежать вариабельности внутри гелей и значительно упрощает их анализ. К недостаткам метода следует отнести то, что он достаточно сложно воспроизводим. Биониканаправление биологии и кибернетики, изучающее особенности морфофизиологической организации живых структур и их использование с целью создания технических систем и устройств по аналогии с живыми системами. Живые организмы на протяжении миллиардов лет прошли долгий путь эволюционных преобразований, осваивая разнообразные среды обитания - водную, наземную, воздушную, постоянно подвергаясь действию элементарных эволюционных факторов. Огромное количество жизненных форм организмов, недостаточно приспособленных к среде обитания, в процессе естественного отбора не оставляли потомства и вымирали. Их место занимали организмы, имевшие более адекватные условиям среды строение и физиологию. Так, организмы, ведущие прикрепленный и неподвижный образ жизни, обычно имеют разного рода опорные и защитные структуры, нередко разветвленное тело, большое количество одинаковых органов, совершенную систему транспортировки питательных веществ и факторов, регулирующих процессы жизнедеятельности, а часто и радиальный тип симметрии. Для расселения в пространстве они используют специальные стадии развития, обладающие способностью к активным или пассивным перемещениям в пространстве. Активно перемещающиеся животные обычно имеют относительно компактное тело, сложный опорно-двигательный аппарат, совершенные органы чувств, развитую нервную систему. Конкретные приспособления к разнообразным средам обитания растений и животных чрезвычайно многообразны. Люди, живя в тесном контакте с природой, постоянно наблюдали и анализировали многообразие адаптаций живых организмов к окружающей среде. На протяжении длительной истории человечества людьми было создано огромное количество разнообразных орудий труда и предметов быта, многие из которых своей структурой соответствовали формам, возникшим в процессе естественной эволюции живых систем. Специалисты в области бионики стремятся не просто подражать живой природе, а использовать принципы организации живых организмов в создании более экономичных, эффективных и эстетичных объектов деятельности. Одним из первых в истории человечества на особенности строения и жизнедеятельности организмов как на возможный источник идей для создания технических приспособлений и орудий труда с научной точки зрения обратил внимание Леонардо да Винчи. Изучив строение крыла птицы, он пытался сделать орнитоптер - искусственное летательное устройство с машущими крыльями. Результаты исследования аэродинамических свойств покровов и крыльев птиц и летающих насекомых и в наше время используются в конструировании современных летательных аппаратов. Широко используемые в технике и в быту пластиковые или резиновые присоски создаются по образу и подобию присосок на щупальцах головоногих моллюсков - кальмаров и осьминогов. Пинцеты и щипцы - инструменты, принцип работы которых соответствует строению и функциям птичьих клювов или клешней высших ракообразных. В моделировании одежды, в быту и в технике в настоящее время широко применяют особые формы крепления - ремешки-липучки. Они обеспечивают надежную фиксацию застежки к ткани за счет расположенных на ней крошечных крючочков, имитирующих структуру поверхности семян некоторых растений из семейств сложноцветных, розоцветных и лютиковых. Принцип работы современных экскаваторов основан на механизмах функционирования роющих конечностей насекомых и млекопитающих, ведущих подземный образ жизни. Исследования особенностей формы тела, а также структуры и физиологии кожных покровов китообразных и рыб лежат в основе создания более быстроходных и экономичных средств водного транспорта. В Японии создано уникальное судно, соответствующее форме тела кита. При этом на фоне уменьшения мощности двигателя его грузоподъемность и скорость остались такими же, как у кораблей, существенно более мощными двигателями. |