Липазы. Липазы и их иммобилизация. Липазы и их иммобилизация Подготовила магистрантка 2 курса вбф

• Название: Липазы и их иммобилизация Подготовила магистрантка 2 курса вбф
• Анкор: Липазы
• Дата: 27.02.2020
• Размер: 7.41 Mb.
• Имя файла: Липазы и их иммобилизация.pptx
• Тип: Документы; #110131

Липазы и их иммобилизация

Подготовила: магистрантка 2 курса ВБФ

Гильфанова М. Р.

Что такое липаза

Липаза (англ. Lipase)— водорастворимый фермент, который катализирует гидролиз нерастворимых эстеров-липидных субстратов, помогая переваривать, растворять и фракционировать жиры.


а) Липаза из Candida rugosa (источник - грибы)

б) Липаза панкреатическая (источник - организм)

а

б

Источники липаз

Растения (например: проростки пшеницы)
Бактерии (Флуоресцирующая псевдомонада и др.)
Организмы (чаще свиньи, овцы, коровы)
Грибы (Candida rugosa/lipolytica/antarctica и др.)

Виды липаз

Лингвальная липаза - оптимум рН - в пределах 4,0–4,5;
Панкреатическая липаза - оптимум работы – 7,5-8,0.
Тканевая липаза - оптимум рН ниже 5.

Модель панкреатической липазы

На рисунке изображено: Трехмерное строение комплекса липаза-колипаза и механизм межфазной активации. Е представляет собой закрытую форму комплекса, которая преобладает в растворе. Открытая форма (E*), вызванная контактом с поверхностью раздела липид-жидкость, обеспечивается конформационными изменениями в крышке и петле β5, раскрывая гидрофобную петлю β9.

Схема активации панкреатической липазы

Выделение липазы

Для выделения фермента необходимо накопление биомассы, потом лизис клеток и последующая очистка конечного продукта. Лизис наиболее удобно производить коммерческими реактивами. Выделение продукта начинается с отделения крупнодисперсного осадка. Отделить осадок можно посредством центрифугирования или фильтрации. Однако в результате мы все равно получаем смесь различных веществ, в которой присутствуют не только белки. Наиболее простым и достаточно грубым способом отделения белковых фракций является переосаждение сульфатом аммония. Переосажденный белок в дальнейшем растворяется и очищается более селективными методами, такими как гельхроматография, аффинная хроматография, ВЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография) и др.

Применение липазы

Пищевая промышленность. Производство ароматизаторов для сыров и для переэтерификации жиров и масел.
Производство моющих средств. Повышает способность моющих средств удалять сильные пятна и делает моющее средство экологически безопасным.
Текстильная промышленность. Удаления смазочных материалов и для получения ткани с большей абсорбирующей способностью для повышения уровня окраски.
Медицинская и фармацевтическая промышленность. Диагностика сердечных заболеваний, заболеваний панкреатической железы. Липазы могут входить в состав лекарственных средств.
В косметике и средствах личной гигиены. Моноацилглицерины и диацилглицерины получают путем этерификации глицеринов и используются в качестве поверхностно-активных веществ в косметической и парфюмерной промышленности.
Производство биодизеля. Реакция переэтерификации, катализируемая липазой, происходит между липидом и короткоцепочечным спиртом для получения сложного эфира и глицерина.
 Липазы в биоремедиации. Очистка сточных вод, деградации разливов нефти в прибрежной среде.

Иммобилизация

Иммобилизация - процесс фиксации соединений на поверхности носителя.

Плюсы и минусы иммобилизации фермента

Наночастицы золота

Наночастицы  золота  ведут  себя  как  ферромагнитные  частицы.
Можно  использовать  для  диагностики  рака,  т.  к.  они  во  много  раз  легче  связываются  с  больными  клетками,  чем  со  здоровыми.  Связанные  наночастицы  хорошо  рассеивают  и  поглощают свет.
Обладают  каталитическими  свойствами.

Применение наночастиц золота

робототехника текстильная,  пищевая  промышленности очистка  воды энергетика электроника экология (фильтры  для  очистки  сточных  вод,  сажевые фильтры) 
В  медицине  для  диагностических  и  терапевтических  целей  при  терапии  опухолей  и  ревматоидного  артрита.  Также  наночастицы  золота  используют  как  носители  для  доставки  лекарственных  веществ,  генетического  материала,  антигенов.

Как синтезировать наночастицы?

Физические методы:
Механические: измельчение различными способами, механосинтез, механическое легирование, процессы испарения (конденсации), фазовые переходы, газофазный синтез нанопорошков с контролируемой температурой и атмосферой, способ электрического взрыва проволок
Химические методы получения:
Осаждение, золь-гель метод, термическое разложение или пиролиз, газовые химические реакции, химическое восстановление, гидролиз, электроосаждение, фото- и радиационно-химическое восстановление, криохимический синтез.
Биологические - внутриклеточный и внеклеточный методы синтеза.

(В реальных методах могут сочетаться и химические и физические методы.)

Наночастицы золота

Золотыe наночастицы: 16 нм наносферы (А), наностержни (Б)
бипирамиды (В)
золотые наностержни с серебряной нанооболочкой (Г), «нанорис» – наностержни Fe2O3, покрытые золотом (Д), нанооболочки SiO2/Au на ядрах двуокиси кремния (Е) (на вставке показан вариант нанооболочки с полым ядром, наночаши с ядром на дне (Ж), нанооболочки SiO2/Au с золотыми шипами («spiky nanoshells»
тетраэдры, октаэдры и кубооктаэдры (И)

Синтез золотого золя

1. Тетрахлороаурат(III) водорода (Gold(III) chloride hydrate) HAuCl4 0.17 мг/мл воды.
2. Борогидрид натрия (Sodium borohydride) NaBH4 0.076 мг/мл воды (по 3 мл в 1 пробирке)
3. В каждую из 4 пробирок с раствором NaBH4 внести по 1 мл HAuCl4, перемешать, поставить в лед на 25-30 мин при постоянном помешивании (использовать шейкер).
4. По истечении 25-30 мин еще раз перемешать растворы в пробирках и оставить в холодильнике на 3-5 дней для созревания золя


HAuCl4 + NaBH4 → Au + ½ H2+ ½B2H6+NaNO3

Растворы наночастиц серебра и золота

С увеличением размера наночастиц цвет становится темнее.

Иммобилизация липазы

На рис. 1: А – синтез золотого золя, В – добавление раствора липазы в золотой золь

Материалы и методы

Наночастицы золота
Свиная панкреатическая липаза - Lipase from Porcine Pancreas (SIGMA, USA).
Субстрат – Триацетин (1,2,3-триацетоксипропан) - эфир глицерина и уксусной кислоты (Triacetin 99+% (C9H14O6), ALDRICH, USA).


+

Триацетин

Глицерол

Уксусная кислота

Липаза

3H2O

3

Исследование активности липазы

Результаты литературных данных

Для проверки качества прохождения реакции соединения липазы с наночастицами золота были проведены спектральные измерения в диапазоне 400-700 нм на спектрофотометре Hitachi U-2900.


По результатам исследований активность липазы соединенной с наночастицами увеличилась на 80% относительно несвязанной. (55%)

Наши результаты