РС. РС для отчета. Материалы и методы
 Скачать 23.96 Kb.
|
|
Введение В странах с умеренным климатом ежегодный эпидемический подъем заболеваемости РС-вирусной инфекцией наблюдается поздней осенью, зимой и ранней весной, в России это период с декабря по март. В сезон эпидемии циркулируют оба известных серотипа РС-вируса, причем более тяжелые формы респираторной инфекции ассоциируются с серотипом А. Известно, что РС-вирусная инфекция не оставляет стойкого иммунитета, поэтому возможна реинфекция в любом возрасте. Сегодня клиницисты широко обсуждают проблему тяжелого течения РС-вирусной инфекции не только у детей раннего возраста, но и у пожилых. У стариков РС-вирус нередко является причиной тяжелых обострений хронических болезней легких и фатальной пневмонии [2]. Благодаря большей точности и более быстрым результатам методы амплификации нуклеиновых кислот в последние десятилетия стали основой в диагностики РС. Используя такой метод, как ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), результаты могут быть доступны в течение 2-24 ч. Однако культура клеток является золотым стандартом выделения вируса. В зависимости от штамма вируса и лаборатории вирусы могут быть выделены в клеточные линии в течение 2-10 дней. В работе представлены результаты анализа взаимодействия РС-вируса с штаммом диплоидных клеток легкого эмбриона человека (ЛЭЧ) и перевиваемой клеточной линии Hela. Материалы и методы. В работе использовали штамм диплоидных клеток ЛЭЧ-3 10-20 пассажного уровня, полученный в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ и линию перевиваемых клеток Hela. Диплоидные клетки культивировали на смеси равных количеств основной среды Игла и 0,5 % раствора гидролизата лактоальбумина с добавлением 10% сыворотка КРС. Клетка Hela выращивали на среде 199 с 10% сыворотки. Цитологический и кариологический анализ клеток проводили по схеме, принятой в лаборатории, с использованием общепринятых методик. Результаты и обсуждение. Диплоидный штамм клеток ЛЭЧ-3, используемый в работе в фазе активной пролиферации, представлял собой фибробластоподобные клетки, обладающие ориентированным ростом, указывающим на наличие контактного торможения. Митотическая активность клеток на 3-е сутки составляла 16-18 ‰. Количество патологических форм митоза было незначительным и составляло не более 1,7% от числа делящихся клеток. Клетки на протяжении всего периода культивирования стабильно сохраняли модальное число хромосом в кариотипе (2n=46). При дифференциальной окраске по G-методу не обнаружено структурных нарушений хромосом. Перевиваемая линия клеток Hela отличалась выраженным полиморфизмом клеток; цитоплазма умеренно вакуолизирована и содержала единичные эозинофильные включения. Ядра клеток крупные, овальные. Количество аномальных форм митоза в этой культуре составляло 25,7% от числа делящихся клеток. Максимальная митотическая активность культуры составила 56-58 ‰ на 3 сутки роста. Количество клеток с аномальными формами интерфазного ядра составляло 5,0-5,5‰. Кариологический анализ клеток Hela выявил широкую вариабельность числа хромосом в кариотипе от 60 до 94. Цитопатические изменения в культуре клеток ЛЭЧ-3 и Hela, зараженных РС-вирусом, носили специфический характер. Первые морфологические изменения в клетках ЛЭЧ-3 были отмечены через 36 часов после заражения и характеризовались появлением очагов округлых клеток. Цитопатические изменения для клеток Hela наблюдались несколько раньше: первые признаки поражения клеточного пласта были отмечены через 24 часа после заражения. Через 48-72 часа в зараженных культурах выделялись отдельные симпласты различной формы: для клеток ЛЭЧ-3 чаще веретенообразной, а для Hela – округлой. В цитоплазме клеток отмечено образование эозинофильных включений. Сравнительное изучение накопление РС-вируса в клетках ЛЭЧ-3 активной фазы роста и перевиваемой линии Hela выявило, что в диплоидных клетках инфекционный титр вируса составлял 5,0-5,5 lg ТЦД50/мл на 5-6 сутки после заражения, что на 1,5-2,0 lg выше, чем для клеток Hela. Контрольные клетки Hela дегенерировали на 6-7 сутки роста, в то время как диплоидные штаммы клеток ЛЭЧ-3 в контроле сохраняли монослой до 14-16 суток. Необходимым условием для понимания патогенеза вирусной инфекции на клеточной уровне является изучение специфичности воздействия РС-вируса на процесс митоза зараженных клеток. Поэтому важным моментом наших исследований явилось изучение влияния РС-вируса на некоторые показатели митотического режима клеток ЛЭЧ-3 и Hela. Митотическая активность клеток ЛЭЧ-3 впервые 24 часа после заражения была увеличена по сравнению с контролем. Однако, по мере развития дегенеративных процессов в культуре под действием вируса митотическая активность клеток снижалась, достигая к 72 часам после заражения 8,8 ‰ (при контроле 16,8 ‰). Величина коэффициента фаз зараженных клеток ЛЭЧ в 1,5-2,0 раза превышала уровень зараженной культуры, что свидетельствует о превалировании числа профаз и метафаз над количеством ана- и телофаз. Митотическая активность клеток Hela, заряженных РС-вирусом, была резко угнетена в течение всего срока наблюдения. Коэффициент фаз для незараженной культуры составлял 1,4, а для инфицированных клеток этот показатель увеличился, достигая к 12 часов после заражения наблюдалось увеличение числа патологических митозов в 1,7 и 2,0 раза соответственно. В обеих клеточных культурах, как в норме, так и при заряжении РС-вирусом, основная доля аномалий митозов была представлена патологическими метафазами. Результаты качественной характеристики патологии метафаз показали, что основную часть патологических митозов в культурах составляли метофазы с отставанием хромосом, колхициноподобные и трехполюсные. Для клеток ЛЭЧ характерной была патология типа пиктнотической телофазы. Оценивая ответную реакцию клеток изучаемых культур на заражение РС-вирусом, можно отметить общую закономерность характерную для клеток эпителиодного и фибробластопободного типа. Однако изменения митотической активности в сравниваемых культурах были различны: стимуляция в фибробластопободных клетках и угнетение в эпителиодной культуре Hela. Таким образом, проведенный анализ чувствительности к РС-вирусу клеточных культур ЛЭЧ и Hela показал, что проявление более четких морфологическихизменений в клетках ЛЭЧ, а также более высокие титры вируса в этой системе, при минимально выраженном числе патологических митозов и более длительной сохраняемости клеточного пласта в контроле, позволяют предпочительно рекомендовать диплоидный штамм клеток ЛЭЧ для работы с РС-вирусом. |